用于无缝合角膜修复的正交胶原蛋白基膜的直写墨水成型

《Acta Biomaterialia》：Direct Ink Writing of an Orthogonal Collagen-Based Membrane for Sutureless Corneal Repair

　　

摘要：天然角膜基质由高度有序的胶原蛋白层片组成，各层片呈现交替取向。然而，在角膜修复中重建这一复杂结构的同时避免缝合相关并发症，仍然是一项重大挑战。本研究在此基础上，基于此前建立的伪轮烷-胶原（PPR-COL）体系，通过直写式3D打印（DIW）制备了具有正交层状结构的PPR-COL膜，并将其与由甲基丙烯酰化明胶和氧化透明质酸组成的生物粘附层整合，实现免缝合固定。系统研究了PPR-COL墨水的浓度依赖性流变行为和打印性能，以确定在挤出能力与结构保真度之间取得平衡的最佳配方。对生物粘附层的化学结构和形貌进行了表征，其最大组织粘附强度达到95.1 kPa。随后的体外实验证实了PPR-COL膜的细胞相容性，并确定了最佳光交联时间。在兔板层角膜移植模型中，打印膜结合生物粘附固定促进了角膜上皮和基质在28天内的修复，并在180天的随访期内维持了良好的效果，经裂隙灯检查、光学相干断层扫描、组织学分析、角膜地形图、生物力学评估和活体共聚焦显微镜检查所证实。综上所述，本研究提出了一种用于胶原基膜制备和免缝合固定的整合策略，为角膜基质重建提供了一种潜在的方法。

意义声明：本研究利用此前建立的伪轮烷-胶原生物墨水，通过直写式3D打印制备了一种生物仿生的胶原基角膜膜。打印膜再现了天然角膜基质的正交层状结构，为角膜基质修复提供了结构有序的胶原替代物。此外，将氧化透明质酸/GelMA生物粘附界面与打印膜整合，实现了与宿主角膜床的稳定免缝合固定。体内板层角膜移植实验显示出了良好的组织整合、角膜重建和长期生物相容性。本工作为开发仿生胶原基角膜替代物提供了一种整合的结构与界面设计策略，并推动了微创角膜修复技术的发展。

引言：角膜是一种透明屈光组织，对视觉功能至关重要。其基质由高度有序的胶原蛋白层片组成，相邻层片中的胶原纤维呈现约90度的正交取向，从而为光学透明性和机械完整性提供了结构基础[1]。角膜基质还含有常驻角膜细胞，这些细胞维持细胞外基质稳态，并参与角膜修复过程中的基质重塑。当角膜完整性因感染、创伤、烧伤或退行性疾病而受损时，可能出现基质混浊、瘢痕和组织缺损，严重时最终导致不可逆的视力丧失[2]。临床上，角膜移植仍是治疗严重角膜损伤的主要方法[3]。然而，供体短缺、免疫排斥和术后并发症限制了其广泛应用。特别是，传统缝合固定可能引起额外的组织损伤、炎症、感染和术后散光[4]。因此，目前仍存在对角膜基质替代物的未满足需求——这些替代物应能重现天然角膜的有序层状结构，同时实现可靠的微创植入[5]。

胶原是角膜基质修复的有前景材料，因为它是天然基质细胞外基质的主要结构成分，且具有优良的组织相容性和组织整合性[6,7]。传统的胶原基角膜替代物通常以浇铸膜、体凝胶或可注射水凝胶的形式制备[[8], [9], [10]]。人们在提高其可植入性、形状适应性和光学性能方面做出了大量努力。例如，Li等人开发了一种可注射光固化水凝胶，由胶原、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和普朗尼克F127二丙烯酸酯组成[8]。结合角膜交联术，该水凝胶作为治疗圆锥角膜的微创疗法显示出良好前景。Lei等人利用胶原纤维的动力学电组装制备了具有预定曲率的三维水凝胶，从而满足了角膜替代物的屈光力需求[10]。这些研究表明，胶原基水凝胶可以设计以满足角膜修复的不同需求，包括微创递送和宏观形状适应。然而，天然角膜基质不仅以其整体几何形状为特征，还以其胶原层片的高度有序空间排列为特征[11,12]。现有的制备策略仍然难以实现对胶原层片可编程组织的精确控制，特别是在构建类似于天然角膜基质的交替层状结构方面。

直写式3D打印（DIW）因其能够实现生物材料的可编程逐层沉积，已成为角膜组织工程中一种有前景的制备策略[13]。这种能力为构建具有交替层状结构的胶原基角膜膜提供了机会[14]。然而，传统胶原材料的机械稳定性有限，可能限制了其满足角膜修复功能需求的能力[15,16]。在我们先前的工作中，我们开发了一种具有优良机械适应性和角膜修复潜力的伪轮烷-胶原（PPR-COL）膜[17]。PPR通过羧甲基-β-环糊精与聚乙二醇之间的主客体相互作用组装而成，调节胶原自组装并作为胶原分子之间的柔性交联剂，从而强化胶原膜。这一已建立的PPR-COL体系为通过DIW制备具有增强机械稳定性的结构有序角膜膜提供了合适的墨水。

然而，打印角膜替代物的临床转化不仅取决于生物仿生结构的重建，还取决于与宿主角膜床的安全微创固定。传统缝合虽然广泛用于角膜移植固定，但不可避免地引入额外的针道创伤，可能导致不规则伤口愈合、炎症、感染和缝线诱导的散光[18]。残留或松动的缝线还可能增加术后管理负担。相比之下，生物粘附介导的免缝合策略有望在提供稳定界面固定的同时，最大限度地减少植入相关组织损伤和光学畸变[[19], [20], [21]]。因此，将DIW生物仿生制备与免缝合固定相结合，代表了一个重要步骤，通过同时解决基质结构恢复和稳定移植固定，推动临床应用角膜基质替代物的开发。

在此，本研究利用PPR-COL墨水通过DIW制备了具有正交结构的膜，并随后将其与基于GelMA和氧化透明质酸的生物粘附层（GelMA-OHA）整合，用于与宿主角膜床的免缝合固定。通过可编程逐层沉积，打印膜被赋予了一种交替层状结构，模拟天然角膜基质的有序胶原结构。此前建立的PPR-COL体系为膜制备提供了合适的材料平台，而GelMA-OHA生物粘附剂使打印膜与宿主组织之间实现了稳定的界面粘附，无需传统缝合。所得整合膜表现出良好的细胞相容性，并在兔板层角膜移植模型中支持了角膜修复。这种整合策略将生物仿生结构制备与免缝合固定相结合，为角膜基质替换中的结构重建和手术稳定提供了一种统一的方法。

节段概述

材料

牛Ⅰ型胶原按照报道的方法提取[22]。透明质酸（HA）、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、高碘酸钠及其他试剂均为分析纯，购自阿拉丁（中国）。所有水样均使用去离子水。

PPR-COL溶液的合成

如我们先前研究所述，伪轮烷（PPR）由聚乙二醇（PEG）和羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD）合成[17]。将PPR溶液与胶原溶液混合以

PPR-COL膜和GelMA-OHA生物粘附剂的设计原理

天然角膜基质由密集排列的胶原层片组成，层片呈交替的近似正交取向[12]。这种高度有序的结构赋予了角膜光学透明性和机械完整性。为重现天然角膜基质的层片特征，利用此前建立的PPR-COL材料体系作为打印墨水，通过DIW制备了PPR-COL膜。通过可编程的逐层沉积

结论

总之，本研究通过直写式3D打印（DIW）开发了一种具有正交排列结构的仿生PPR-COL膜。流变分析证实了PPR-COL墨水适用于DIW工艺，能够实现结构有序膜的可重复制备。进一步引入了基于GelMA和OHA的生物粘附剂，为PPR-COL膜与宿主角膜床之间的稳定固定提供了方案，无需传统缝合。该

CRediT作者贡献声明

C.D.：方法论、调研、软件、可视化、撰写——初稿；
X.C.：概念构思、方法论、调研、资源、验证；
Y.W.：软件、形式分析、数据管理；
K.C.：软件、验证；
G.C.：调研；
Y.X.：调研；
J.Y.：概念构思、监督、项目管理、资金获取、撰写——审阅与编辑；
M.Z.：概念构思、监督、资金获取、撰写——审阅与编辑。
C.D.和X.C.贡献相等

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在本工作的准备过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）辅助语言编辑并提高稿件的清晰度和可读性。作者随后审阅并编辑了所有AI辅助内容，对已发表文章的内容承担全部责任。

利益声明

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CRediT作者贡献声明

Ding Cui Cui：可视化、软件、方法论、调研。Chen Xiao Hong：验证、资源、方法论、调研、概念构思。Wang Yue：软件、形式分析、数据管理。Cheng Kuan：验证、软件。Chen Guan Yu：调研。Xia Yu Xin：调研。Yu Jing Jing：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思。Zhang Min：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思。

Ding Cui Cui | Chen Xiao Hong | Wang Yue | Cheng Kuan | Chen Guan Yu | Xia Yu Xin | Yu Jing Jing | Zhang Min