基于体外组合筛选的Fridericia chica标准化提取物与Bixa orellana生育三烯酚富集组分联用促进胃黏膜保护作用研究

《Pharmaceutical Biology》：Fridericia chica standardized extract combined with tocotrienol-enriched fraction from Bixa orellana promotes gastric mucosal protection: in vitro combination selection and in vivo evaluation

　　

摘要专业翻译 背景： Fridericia chica（Bonpl.）L.G. Lohmann是一种富含具有生物活性3-脱氧花青素（3-deoxyanthocyanidins）的药用植物，已有研究报道其具有伤口愈合和胃保护特性。来源于Bixa orellana L.的70%生育三烯酚富集组分（tocotrienol-enriched fraction，TRF）具有抗氧化和抗炎活性，可能对F. chica在胃黏膜保护方面发挥互补作用。 目的： 本研究旨在评价F. chica–TRF联合用药的胃保护和胃组织修复作用。 材料与方法： 将干燥的F. chica标准化粗提物单独或与TRF按不同比例联合，在HaCaT角质形成细胞和3T3成纤维细胞中进行体外试验，评估细胞活力并选择适合后续体内研究的组合比例。随后，将选定比例在雌性Wistar大鼠的急性和慢性胃溃疡模型中开展研究。 结果： 在体外测试的各比例中，90:10（F. chica:TRF）比例显示出最优的细胞活力特征，并被选定用于体内评价。该联合用药减少了胃损伤并显著增加了胃黏液产生。在慢性溃疡模型中，治疗与TNF-α和IL-1β水平降低以及IL-10水平升高相关。组织病理学和二次谐波产生（second-harmonic generation，SHG）分析定性表明黏膜保留、组织有序性和胶原沉积。 结论： F. chica–TRF联合用药表现出胃保护作用，与黏液产生增加和炎症介质调节相关。定性形态学发现进一步表明胃组织结构和胶原组织的保留，支持该联合用药作为基于天然产物的胃黏膜保护策略的潜力。

论文解读

一、研究背景与意义

胃溃疡是全球最常见的消化系统疾病之一，以黏膜糜烂和胃部缺损为特征。流行病学数据显示，1990年至2019年间，包括胃溃疡和十二指肠溃疡在内的消化性溃疡全球发病率上升了27.3%，2019年全球患病约809万例，较1990年增加25.82%。胃溃疡的病因涉及多因素，本质上是黏膜保护因素与攻击因素之间的失衡。保护因素包括黏液、前列腺素、一氧化氮、碳酸氢盐、生长因子、内源性抗氧化剂及充足血流的有序产生；内源性攻击因素则包括盐酸和胃蛋白酶的过量产生、胆汁反流、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、血流减少以及幽门螺杆菌感染。1990至1995年间开展的临床和流行病学研究荟萃分析确认，非甾体抗炎药（NSAIDs）使用、幽门螺杆菌感染和吸烟是主要危险因素，占该时期溃疡病例的89%至95%。

20世纪70年代，西咪替丁（组胺H₂受体拮抗剂）的引入代表了胃溃疡治疗的重要进展；1982年，奥美拉唑（质子泵抑制剂，H⁺/K⁺-ATPase）问世，直接作用于酸分泌的最终步骤。然而，这些药物伴随严重不良反应：质子泵抑制剂与骨折、肾脏疾病、感染以及钙、镁和维生素B12营养缺乏风险增加相关，还可能放大NSAIDs诱导的损伤并增加胃癌风险；雷尼替丁则因检出致癌物质N-亚硝基二甲胺（NDMA）在多个国家被撤市。在此背景下，寻找低毒性、易获得且低成本的药物引发了对传统医学和天然产物作为新药来源的研究兴趣。

Fridericia chica（同义词Arrabidaea chica）是一种分布于巴西、哥斯达黎加、巴拉圭、法属圭亚那等热带美洲国家的灌木植物，在巴西俗称crajiru或pariri。既往研究已证明该植物对外部伤口和胃溃疡具有愈合活性。在一项II/III期临床试验中，接受骨髓移植的肿瘤血液病患者被随机分配接受含2.5% F. chica黏膜粘附凝胶或低水平激光治疗口腔黏膜炎，结果显示干预组黏膜炎平均愈合时间为5.2±1.5天，对照组为11.2±6.5天，含F. chica标准化粗提物的凝胶愈合速度快2.2倍。这种愈合效应归因于植物中存在的3-脱氧花青素——6,7,3,4-四羟基-5-甲氧基黄烯、6,7,4′-三羟基-5-甲氧基黄烯和6,7-二羟基-5,4-二甲氧基黄烯——这一选择性类黄酮群以其抗氧化能力著称。

基于F. chica和生育三烯酚各自的抗氧化和抗炎特性，研究人员将70%生育三烯酚富集组分（TRF，Bixa orellana胭脂树红素生产的副产物，通过专利分子蒸馏工艺获得）与标准化F. chica提取物联合研究。尽管F. chica和生育三烯酚的胃保护作用已被分别研究，但二者联合对胃黏膜保护和组织修复的作用尚未确立，且缺乏基于细胞活力选择合适组合比例的研究。因此，本研究假设：基于体外细胞活力选择的F. chica–TRF组合将在实验性溃疡模型中发挥胃保护作用并调节与胃黏膜保护和组织修复相关的参数。

二、主要关键技术方法

本研究采用以下关键技术方法：①HPLC-UV/Vis色谱分析，对F. chica标准化粗提物中特征性3-脱氧花青素（3′-羟基-carajurone、carajurone、carajurin）及芹菜素（apigenin）和木犀草素（luteolin）进行定性和定量分析；②体外细胞活力评价，采用磺酰罗丹明B（SRB）法在HaCaT人永生化角质形成细胞和NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞中测定F. chica与TRF单独及不同比例（90:10、95:5、99:1）联合的半数抑制浓度（IC₅₀），并通过等效应图（isobologram）分析选择最优组合比例；③体内药效学评价，采用乙醇诱导急性胃溃疡模型（雌性Wistar大鼠，每组6只）和乙酸诱导慢性胃溃疡模型（每组4只），通过ImageJ软件定量溃疡面积、阿利新蓝法测定胃黏液含量、幽门结扎法评价胃酸分泌、组织病理学（H&E和Masson三色染色）及二次谐波产生（SHG）显微镜定性评价组织形态和胶原纤维排列；④多重免疫磁珠检测法（MILLIPLEX MAP）定量胃组织TNF-α、IL-1β和IL-10炎性细胞因子水平。

三、研究结果

化学表征： HPLC-UV/Vis定性分析确认了F. chica特征性3-脱氧花青素的存在：3′-羟基-carajurone（保留时间7.8 min）、carajurone（9.4 min）和carajurin（11.6 min）；在375 nm处鉴定出木犀草素（12.8 min）和芹菜素（14.6 min）。以分离的carajurin作为分析参考标准进行定量标准化，同时使用商业标准品定量芹菜素和木犀草素。

体外药理学评价： 在HaCaT细胞中，F. chica在5% FBS条件下浓度达6.25 μg/mL时细胞活力略有增加；在0.2% FBS生长受限条件下活力范围为75%至100%。50和100 μg/mL浓度在两种条件下均表现细胞毒性。TRF在5% FBS条件下12.5 μg/mL时活力降至75%至100%之间，25和50 μg/mL时活力降至25%以下；0.2% FBS条件下12.5 μg/mL起活力降至约25%。正常生长条件下IC₅₀值：F. chica为47.8 μg/mL，TRF为16.6 μg/mL。在3、10、30和100 μg/mL浓度下评价不同比例组合，HaCaT细胞IC₅₀为F. chica 23.49 μg/mL、TRF 47.75 μg/mL；3T3细胞为F. chica 80.45 μg/mL、TRF 63.99 μg/mL。等效应图分析表明，90:10和99:1比例细胞毒性最低，细胞活力维持在50%以上，最终选定90:10比例用于体内研究。

剂量-反应曲线： 在乙醇诱导溃疡模型中，F. chica + TRF（90:10）组合以30、100和300 mg/kg给药，剂量-反应关系呈非线性模式。通过二阶多项式插值作为探索性方法，约150 mg/kg剂量对应于相对溃疡面积50%，据此选定150 mg/kg（ED₅₀）用于后续实验评价。

急性乙醇诱导溃疡效果： 所有治疗均较溶剂组减少溃疡面积，愈合百分比分别为：F. chica 67.9%、TRF 66.8%、甘珀酸钠（carbenoxolone）82.8%、F. chica + TRF组合76.5%。

胃黏液定量： 甘珀酸钠（200 mg/kg）和F. chica + TRF组合显著增加胃黏液含量（10.28±1.08和10.65±1.37 μg阿利新蓝/g组织，p<0.05），溶剂组为1.26±0.12 μg/g；单独F. chica和TRF分别为6.46±0.61和9.02±1.21 μg/g。

胃酸分泌评价： 幽门结扎模型中，除西咪替丁（100 mg/kg）和TRF（15 mg/kg）外，其余治疗在pH变化和总酸度方面与溶剂组无显著差异。

急性溃疡组织病理学： 溶剂组显示广泛胃黏膜损伤，伴脱屑、胃小凹增宽、血细胞、炎性浸润和黏膜下水肿，胶原纤维排列紊乱。甘珀酸钠组黏膜保留，炎性浸润轻微，胶原沉积少且有序。F. chica组黏膜保留，炎性浸润减少，但黏膜下水肿持续。TRF组黏膜保留，胶原沉积集中在黏膜下区域且纤维有序性低。F. chica + TRF组合组黏膜完整且增厚，无黏膜下水肿，SHG图像显示胶原纤维沿黏膜下有序排列，与阳性对照组模式相似。

慢性乙酸诱导溃疡效果： 所有治疗均减少溃疡面积。溶剂组面积为12.33±1.45 mm²，西咪替丁和F. chica + TRF组面积最小，分别为3.00±0.40 mm²和1.97±0.03 mm²；单独F. chica和TRF分别为6.50±1.19 mm²和5.67±1.76 mm²。治疗期间体重变化显著但非治疗依赖性，无治疗相关临床体征。

慢性溃疡组织病理学： 溶剂组胃黏膜广泛损伤，层结构紊乱，炎性浸润，黏膜下层与肌层界限丧失，壁细胞和主细胞变性，胶原沉积弥散且纤维紊乱。西咪替丁组黏膜部分保留，黏膜下出现肉芽组织和新生血管，胶原沉积较溶剂组有序。F. chica、TRF和组合治疗组均显示黏膜保留，伴空泡化壁细胞和增宽胃小凹，可见肉芽组织和新生血管区域，胶原在肉芽组织区域沉积，高组织有序性区域纤维沿黏膜下排列更明确；F. chica + TRF组合组还观察到组织架构保留区域。

慢性溃疡炎性细胞因子定量： TRF和F. chica + TRF组合组TNF-α水平显著降低（p<0.05）。IL-1β方面，所有治疗均较溶剂组显著降低：西咪替丁降低31.8%（p<0.05），F. chica降低40.5%（p<0.01），TRF和组合分别降低79.7%和80.9%（p<0.001）。IL-10方面，F. chica和组合组显著升高（p<0.01），分别升高67.9%和66.6%；西咪替丁和TRF组分别升高26.37%和59.1%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，角质形成细胞和成纤维细胞是愈合增殖期的主要细胞，适合用于细胞毒性评价。高浓度下两种提取物的细胞毒性可能与酚类化合物在培养基中形成过氧化氢等氧化产物有关。等效应图分析在本研究中的目的不同于传统细胞毒联合研究——目标不是识别细胞毒性的协同增强，而是选择最能保持细胞活力的比例用于体内评价。90:10比例因在两种细胞系中始终表现出细胞活力保持与体内适用性的最佳平衡而被选中。剂量-反应曲线的非线性模式与文献中TRF高剂量下出现红斑、接触性皮炎及口服时生化改变的报道一致。

胃保护机制方面，F. chica可能通过抑制15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）增加胃黏膜前列腺素可用性，同时涉及脂质过氧化降低、抗氧化酶活性增强（GSH和SOD）及炎性细胞因子调节；生育三烯酚则通过增加COX-1表达和PGE2产生、自由基清除、增强抗氧化酶活性、通过降低iNOS表达使胃黏膜NO正常化以及调节炎性细胞因子发挥作用。这些机制为观察到的胃黏液产生增加提供了药理学背景。

抗分泌实验显示F. chica粗提物未显著降低胃液量、总酸度和游离酸度，与既往研究差异可能与提取物组成、剂量和实验条件有关。慢性溃疡中，TRF可能主要贡献于促炎介质降低，而F. chica可能贡献于IL-10升高，提示二者在炎症调节中具有互补作用。

研究局限性包括：组织病理学评估未设盲、SHG分析为定性而非定量、未直接测量氧化应激标志物、慢性溃疡模型最终样本量较小（每组4只）。

结论：F. chica与生育三烯酚富集组分的联合用药表现出显著的抗溃疡作用，促进胃黏液产生增加、调节炎症反应并保留胃组织学结构。尽管在实验条件下未证明经典药理学协同作用，但联合用药在选定比例下表现出胃保护活性，凸显了基于天然产物开发治疗策略的潜力。未来研究应进一步探讨氧化应激和炎症调节相关通路（包括Nrf2/HO-1和NF-κB信号）及前列腺素的潜在参与，开展药代动力学研究表征系统暴露和生物利用度，并进行长期毒理学评价以全面表征联合用药的系统安全性。