基因重编程外泌体用于靶向前列腺癌免疫治疗

《Acta Biomaterialia》：Genetically Reprogrammed Exosomes for Targeted Prostate Cancer Immunotherapy

　　

摘要

前列腺癌（PCa）是全球男性癌症死亡的主要原因之一，至今仍未找到根治方法，凸显了创新治疗方案的迫切需求。外泌体是由细胞分泌的膜性囊泡，在细胞间通讯中发挥关键作用，在药物递送与开发领域引起了广泛关注。在本研究中，我们利用遗传学方法在外泌体表面同时展示抗人前列腺特异性膜抗原（PSMA）和抗人CD3抗体。通过同时靶向T细胞和PCa肿瘤，所得到的前列腺癌免疫治疗外泌体（PRO Exos）旨在诱导强烈的抗肿瘤细胞免疫反应。体外和体内研究表明，其对表达PSMA的PCa细胞具有强大的T细胞介导的细胞毒性作用。我们的发现凸显了基因重编程外泌体在靶向PCa免疫治疗方面的潜力，代表了一种对抗PCa的有前景的方法。

意义声明

本工作报道了基因重编程外泌体作为一种前列腺癌免疫治疗方法的开发。通过在外泌体表面展示两种不同类型的单克隆抗体，所制备的外泌体能够同时与人体T细胞和前列腺癌细胞结合，从而激发强大的抗肿瘤免疫反应。作为一种潜在的通用平台，免疫治疗外泌体提供了一种具有良好疗效和安全性的策略，通过诱导宿主免疫反应来对抗前列腺癌。

引言

前列腺癌（PCa）是全球男性生殖系统中恶性程度最高的癌症[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]]。PCa患者的传统治疗选择包括手术、化疗、放疗和激素治疗[1,8]。尽管在早期检测和治疗方面取得了成功，但晚期PCa要实现有效的长期预后仍然是一个挑战[9]。因此，开发创新的治疗策略以满足未被满足的医疗需求至关重要。

外泌体是由各种细胞类型释放的磷脂双分子层膜囊泡。它们携带多种内容物，如脂质、核酸、蛋白质和代谢物。内源性外泌体通过与表面受体和配体结合以及递送功能性货物来参与细胞间通讯，从而调节信号通路和下游基因表达[[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]]。鉴于其良好的生物相容性和低免疫原性，细胞来源的外泌体已被开发为药物递送平台[[21], [22], [23]]。大量研究报告通过不同方法将小分子、核酸和蛋白质负载到外泌体中[10,[24], [25], [26], [27], [28]]。这些外泌体介导的治疗性递送在肿瘤、缺血和神经退行性疾病等临床适应症中显示出良好的疗效和安全性[[29], [30], [31], [32], [33], [34]]。

我们近期开发了一种在癌症免疫治疗中外泌体表面遗传性展示两种不同类型单克隆抗体的方法[[35], [36]]。通过同时靶向肿瘤相关抗原和T细胞标志蛋白，基因工程改造的外泌体可诱导强烈的肿瘤特异性细胞免疫。考虑到前列腺特异性膜抗原（PSMA）在PCa肿瘤中经常高表达，我们设想外泌体同时识别PSMA阳性癌细胞和T细胞可能成为对抗PCa的一种策略。为此，我们将特异性针对人T细胞CD3和PSMA的单链可变片段（scFv）抗体串联融合在人血小板衍生生长因子受体（PDGFR）跨膜结构域（TMD）的N端，以实现在外泌体表面的共展示（图1）。所设计的外泌体被称为前列腺癌免疫治疗外泌体（PRO Exos），可招募细胞毒性T细胞至PCa肿瘤进行消除，为PCa免疫治疗提供了一种基于工程化外泌体的方法。

章节摘要

材料与方法

细胞培养。 LNCaP、C4-2、DU145和Jurkat细胞在含有10% FBS（Corning，美国纽约州）的RPMI-1640培养基（Corning，美国纽约州）中培养，温度为37°C，5% CO₂。Expi293F细胞在BalanCD HEK293培养基（FUJIFILM Biosciences，美国加利福尼亚州）中于37°C、5% CO₂条件下以125 rpm转速摇床培养。人外周血单核细胞（PBMCs）购自Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。

动物实验。 所有动物实验方案均经南加州大学 Institutional Animal Care and（机构动物护理与使用委员会）批准。

结果

为开发用于PCa免疫治疗的外泌体，我们选择通过PDGFR TMD融合蛋白在外泌体表面展示针对人泛T细胞标志物CD3和PCa相关PSMA抗原的单克隆抗体（图2A和S1A）。抗CD3 scFv（克隆：UCHT1）和抗PSMA scFv（克隆：J591）抗体通过(GGGGS)₃柔性连接子连接，并置于PDGFR TMD的前方[[37], [38], [39]]。这种分子设计确保两种scFv抗体以确定的方式在同一囊泡上共展示

讨论

本研究展示了通过基因重编程在外泌体表面同时展示针对PCa相关PSMA抗原和T细胞CD3标志物的scFv抗体来制备PRO Exos。与主要作为包裹治疗性货物的递送载体的外泌体不同，PRO Exos是多价细胞结合纳米囊泡，能够在T细胞和PSMA阳性PCa细胞之间架起物理桥梁。通过PDGFR TMD锚定的串联αCD3 scFv-αPSMA scFv融合蛋白确保两者均

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经南加州大学批准。

作者贡献

G.K.和Y.Z.设计研究。G.K.、L.Z.、S.H.K.、Q.H.、Z.Z.、K.S.、J.S.、A.A.和Z.D.开展研究。J.K.P.和P.M.S.提供资源和关键见解。G.K.、L.Z.和Y.Z.分析数据。G.K.、L.Z.和Y.Z.撰写论文。

数据可用性

支持本研究结果的所有数据均包含在正文和补充信息中。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

补充信息

补充信息包括补充结果。

CRediT作者贡献声明

Guoyun Kao：写作—初稿、调查、正式分析、概念构思。Lei Zhang：写作—初稿、调查、正式分析。Sunny H. Kim：调查。Qianyuan He：调查。Zeyu Zhang：调查。Kaiyu Shen：调查。Jianfei Shi：调查。Zhefu Dai：调查。Angela Albanese：调查。Paul M. Seidler：资源。Jacek K. Pinski：资源。Yong Zhang：写作—审稿与编辑、资金获取、正式分析，

Guoyun Kao|Lei Zhang|Sunny H. Kim|Qianyuan He|Zeyu Zhang|Kaiyu Shen|Jianfei Shi|Zhefu Dai|Angela Albanese|Paul M. Seidler|Jacek K. Pinski|Yong Zhang