基于活性位点高度保守水分子理性设计抗耐药杂草的高效磺酰脲类乙酰羟酸合酶抑制剂

《Advanced Agrochem》：Rational discovery of potent sulfonylureas against resistant weed incorporating highly conserved waters in the binding-site of acetohydroxyacid synthase

　　

磺酰脲类（SUs）除草剂是过去半个世纪中广泛使用的除草剂，但靶位点突变导致的杂草抗性已严重威胁其应用前景。本研究首次对来自多个物种的乙酰羟酸合酶（AHAS，EC 2.2.1.6，又称乙酰乳酸合酶，ALS）催化亚基的全部晶体结构进行了系统分析，发现活性位点中存在两个高度保守的水分子（w1和w2），它们靠近氯嘧磺隆（CE）的酯键连接处和苯环连接位点。基于此结构信息，研究人员以CE为先导化合物，设计并合成了64个新型磺酰脲类化合物，通过在苯环酯基末端引入卤素或羟基基团，以期与保守水分子形成额外氢键。酶动力学测定显示，化合物4d对野生型拟南芥AHAS（AtAHAS）的抑制常数Ki为11 nM，对P197L突变体的Ki值为68 nM，抗性因子（Rf）仅为6.2，远优于商品化除草剂CE（Rf=33）。温室盆栽试验表明，4d在1.875 g ha-1的超低剂量下对携带P197L突变的抗性播娘蒿（Descurainia sophia）仍表现出>90%的除草活性，且在30 g ha-1的施药量下对五种小麦品种安全。通过解析4d与野生型AtAHAS及P197T突变体的复合物晶体结构，研究人员在实验中直接观察到了设计预期的氢键相互作用：4d末端氟原子与保守水分子w1及羟乙基硫胺素焦磷酸（HoeThDP）的羟基形成氢键。此外，该研究首次证明时间依赖性累积性抑制可作为评估AHAS抑制剂除草活性的重要预测工具，这为解释化合物在体外酶抑制活性与体内除草活性之间的差异提供了新思路。本研究验证了在AHAS活性位点设计中考虑水分子网络的分子设计策略，为开发针对P197突变所致抗性杂草的新一代磺酰脲类除草剂提供了理论基础和实验依据。

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一、研究背景与科学问题

杂草防除在现代农业中至关重要，直接关系到粮食供应的充足性和经济性。磺酰脲类（SUs）除草剂自半个世纪前发明以来，凭借其超低用量、优良的作物选择性以及低哺乳动物毒性，一直是除草剂市场的重要品类，迄今已有约40个品种实现商业化。该类除草剂的靶酶为乙酰羟酸合酶（AHAS，EC 2.2.1.6，又称乙酰乳酸合酶，ALS），它是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。抑制AHAS会导致这些必需氨基酸耗竭，从而影响杂草的生长和分裂，最终导致死亡。

然而，自1987年首次在刺莴苣中发现杂草对SU除草剂产生抗性以来，目前已有176种杂草被报道对SUs或其他化学家族的AHAS抑制剂产生抗性。抗性产生的主要机制之一是AHAS靶位点突变导致除草剂结合亲和力下降。在国际抗除草剂杂草数据库中，197个分离物中有91个突变发生在P197位点（氨基酸编号基于拟南芥AHAS序列），其中P197L是最常见的突变类型之一，所有报道的携带该突变的杂草（包括反枝苋、播娘蒿、猪殃殃和硬直黑麦草等严重危害作物生产的恶性杂草）均对商品化SUs高度抗性。

尽管过去二十年中AHAS抑制剂的分子作用机制已在原子水平上得到充分阐明，但针对P197L突变设计新型抑制剂的研究进展有限，主要障碍包括：新化合物在温室盆栽试验中需要较高的施药量；酶抑制活性与除草活性之间存在不一致性；缺乏与AHAS的共晶结构导致难以解释抑制剂的分子作用基础。值得注意的是，在以往的设计策略中，除草剂结合位点内的水分子结构从未被纳入考虑。

二、研究内容与总体结论

研究人员对来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、白色念珠菌（Candida albicans）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等多个物种的31个AHAS催化亚基晶体结构进行了全面分析，发现活性位点中存在两个高度保守的水分子w1和w2。w1在31个结构中的28个中被观察到，w2在19个结构中被发现。这两个水分子靠近氯嘧磺隆（CE）的酯键连接处和苯环连接位点，距离为3.3–4.1 ?。基于此发现，研究人员提出假设：如果对CE的结构进行修饰，在酯基末端引入能够与水分子形成氢键的原子，可能产生与AHAS结合亲和力增强的新化合物。

据此，研究人员以CE为先导化合物，设计并合成了64个新型磺酰脲类化合物，将苯环上的酯基分别替换为-CH₂CH₂CH₂F、-CH₂CH₂CH₂Cl、-CH₂CH₂CH₂Br、-CH₂CH₂CH₂I、-CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂Cl、-CH₂CH₂CH₂CH₂Br、-CH₂CH₂CH₂CH₂I和-CH₂CH₂CH₂CH₂OH等取代基。

酶动力学筛选表明，化合物4d对野生型AtAHAS的K_i值为11 nM，对P197L突变体的K_i值为68 nM，抗性因子（R_f）仅为6.2，显著优于CE（R_f=33）、苄嘧磺隆（BSM，R_f=97）和醚苯磺隆（TM，R_f>66）。温室盆栽试验显示，4d在1.875 g ha^-1的超低剂量下对敏感播娘蒿和P197L抗性播娘蒿分别表现出92%和91%的生长抑制率，而CE和BSM在此剂量下已完全丧失对耐药杂草的除草活性。4d在30 g ha^-1的施药量下对中国五种小麦品种的生长抑制率均低于10%，表明其具有广阔的作物安全窗口。

三、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：基于31个AHAS晶体结构的生物信息学分析，系统鉴定活性位点中高度保守的水分子及其与底物/抑制剂的相互作用；基于结构的理性药物设计，以CE为先导化合物设计系列新型磺酰脲类化合物；化学合成方法，通过糖精水解、酯化反应等步骤合成64个目标化合物；酶动力学抑制活性测定，计算K_i值和抗性因子；时间依赖性累积性抑制动力学分析，拟合k_iapp/k₃比值评估累积抑制强度；温室盆栽除草活性及作物安全性评价；蛋白质晶体学方法，解析化合物与野生型AtAHAS及P197T突变体的复合物晶体结构。

四、研究结果

4.1 活性位点高度保守水分子的鉴定

通过对31个AHAS晶体结构的系统分析，研究人员发现两个高度保守的水分子w1和w2存在于活性位点中。w1在28个结构中被观察到，与AtAHAS中的T167、S168和Q207三个残基形成多重氢键；w2在19个结构中出现，与G121和Q207形成氢键。在CE与AtAHAS和ScAHAS的复合物结构中，w1与酯基末端碳原子的距离为3.3 ?，w2的距离为4.1 ?和3.9 ?。值得注意的是，w1的位置与O₂结合AHAS时的位置相同，这为后续解释累积性抑制机制提供了结构基础。

4.2 新型磺酰脲类化合物的设计与合成

基于保守水分子分析，研究人员设计了系列化合物，在苯环酯基末端引入卤素或羟基。合成路线中，含-CH₂CH₂CH₂F基团的中间体2的合成未见文献报道，研究人员通过温度控制实现选择性反应：在70 °C时碘原子被氨基亲核取代，而在0 °C时羟基与1-氟-3-碘丙烷反应得到目标产物3-氟丙基2-氨磺酰苯甲酸酯，这归因于动力学控制与热力学控制的差异。

4.3 体外AtAHAS抑制活性与盆栽试验

64个化合物的K_i值范围为11 ± 2 nM至大于5 μM，其中21个化合物的K_i值低于100 nM。化合物4c、4d、4i、4x、4aj、4bb、4bc和4bd的K_i值均低于CE（32 nM）。对P197L突变体的抑制测定显示，9个化合物保持强抑制活性，K_i值范围为68 nM至3.9 μM。4c（R_f=6.2）、4d（R_f=6.2）和4i（R_f=8.9）的抗性因子显著优于CE（33）。盆栽试验中，4c和4d在1.875 g ha^-1剂量下对P197L抗性播娘蒿分别保持77%和92%的抑制率，而CE和BSM完全丧失活性，TM降至43%。

4.4 时间依赖性累积性抑制

对野生型AtAHAS，4c、4d和4i及三种商品化除草剂均表现出时间依赖性累积性抑制，与盆栽试验中所有化合物对敏感播娘蒿的活性一致。对P197L突变体，4c和4d的累积性抑制仍然较强，k_iapp/k₃值分别为15和22，而4i的累积性抑制非常微弱。这一结果与盆栽试验高度吻合：4c和4d在1.875 g ha^-1下保持强除草活性，而4i即使在7.5 g ha^-1下也无除草活性。该研究首次直接比较了除草活性与k_iapp/k₃值，证明高k_iapp/k₃值预示强除草活性。

4.5 野生型AtAHAS与4c、4d和4i的复合物晶体结构

复合物晶体结构分辨率范围为2.53–2.62 ?。4c和4i存在U型和L型两种构象，而4d主要以U型构象结合。在所有结构中，杂环部分与W576形成π-π堆积，R373、K256和S653与磺酰脲桥形成关键氢键，P197与苯环形成T型π堆积。关键发现是：4c和4d的末端氟原子与保守水分子w1形成氢键，同时意外地与羟乙基硫胺素焦磷酸（HoeThDP）的羟基形成氢键。HoeThDP是ThDP的羟乙基互变异构形式，其被稳定捕获正是由于与抑制剂氟原子的氢键作用。4i中的氯原子因体积较大，在空间上受阻，难以形成该构象。

4.6 P197T突变体AtAHAS与4c和4d的复合物晶体结构

P197T突变体的复合物结构中，4c和4d均只呈现单一构象（U型），尾部指向HoeThDP和保守水分子w1。关键机制是：P197T突变后，主链氮原子可用于与抑制剂形成氢键，4c的羰基翻转近180°、4d的羰基微调后均与T197的主链氮原子形成氢键。相比之下，CE与P197T突变体复合物中羰基氧与主链氮原子的距离为4.5 ?，无法形成氢键。这解释了CE的R_f值（33）远高于4c和4d（6.1）的结构基础。

五、讨论与结论

本研究提出了一种新的磺酰脲类除草剂设计策略，即利用AHAS活性位点中高度保守的水分子网络来设计能够形成额外氢键的抑制剂，从而部分克服P197L和P197T突变导致的抗性问题。该策略基于对全部已发表的AHAS晶体结构的系统分析，首次将活性位点水分子结构纳入除草剂理性设计考量。

研究还发现，磺酰脲类除草剂结合野生型AtAHAS时可呈现多种构象，而结合P197T突变体时仅呈现单一构象。氟原子在与w1和HoeThDP形成氢键方面效果最佳，而体积较大的卤素原子（如氯）可能因空间位阻而无法采用该构象。w1在这些结构中保持结合也意味着活性位点仍有足够空间供O₂结合，因此含氧副反应可继续发生，累积性抑制得以保持。

该研究首次具体证明了时间依赖性累积性抑制测量可作为评估AHAS抑制剂除草活性的重要预测工具。K_i值仅相差两倍的4i与4c/4d在抗性杂草上的除草活性差异巨大，而累积性抑制的差异恰好解释了这一现象，表明累积性抑制值比K_i值更能反映生物学活性。研究结论指出，将累积性抑制与低K_i值相结合的化合物具有成为除草剂的巨大潜力；即使K_i值较弱（>约4 μM）的化合物，只要具有可测量的累积性抑制水平，仍可被视为候选除草剂。该研究为开发针对P197突变所致抗性杂草的新一代磺酰脲类除草剂提供了创新的分子设计方法和重要的实验依据。