利用纳米酶实现的比色免疫测定法，通过智能手机读取结果，用于检测血清中小细胞肺癌的生物标志物

《Analytica Chimica Acta》：Nanozyme-enabled colorimetric immunoassay with smartphone readout for serum small cell lung cancer biomarkers

　　

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  开发了一种针对NSE和ProGRP的双目标纳米酶免疫测定方法。
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  具有增强过氧化物酶活性的Au@Pt纳米酶可实现信号放大。
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  基于磁珠的捕获技术可有效分离血清中的目标物质。
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  智能手机辅助的RGB读数技术可实现亚皮克级的检测限。
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  该测定方法能够以高AUC值区分小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。

引言

肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，每年导致约182万人死亡（GLOBOCAN 2022）[1]。小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性的神经内分泌亚型，占所有肺癌的10-15%，其特征是快速增殖、早期扩散、对初始治疗的敏感性高以及频繁复发，导致长期生存率较低[2] [3]。尽管在分子表征和免疫疗法方面取得了进展，但大多数SCLC患者获得的持久疗效有限，因此仍需要可靠的生物标志物来进行患者分层、疾病监测和治疗评估[4] [5] [6]。在循环生物标志物中，神经元特异性烯醇酶（NSE）和胃泌素释放肽前体（ProGRP）已被广泛研究作为与SCLC相关的血清生物标志物[7] [8] [9]。这两种物质在健康个体中都以可测量的生理水平存在，其临床意义取决于定量变化而不仅仅是简单存在。虽然它们都不是SCLC的特异性标志物，但NSE反映了神经内分泌分化及肿瘤负荷，而ProGRP对SCLC的特异性更高，并有助于将其与其他类型的肺癌区分开来。因此，它们的互补特性支持联合定量评估，强调了需要一个能够在血清中同时测定NSE和ProGRP的分析平台。

已经开发了多种NSE和ProGRP的分析方法。传统的自动化免疫测定平台仍被广泛用于血清NSE和ProGRP的测量，但通常依赖于中央实验室仪器和标准工作流程[9] [10]。更先进的平台包括基于DNA链的荧光纳米探针用于双重生物标志物检测[11]、免疫亲和力自上而下的质谱法用于NSEγ的分子特异性定量（尽管需要复杂的仪器）[12]，以及电化学发光[13]或无线免疫传感[14]用于超灵敏检测。针对NSE的单目标传感策略也有所发展，包括荧光传感器和光电化学免疫传感器[15] [16]。尽管有这些进步，许多方法仍然依赖专用仪器、复杂的信号读取或设备集成平台[17] [18]。因此，一种可视化且可进行图像量化的比色平台对于血清分析仍然具有吸引力。

自从发现Fe₃O₄纳米粒子具有内在的过氧化物酶活性以来[19]，纳米酶因其催化活性、结构稳定性、可调的表面化学性质以及与生物分析格式的兼容性而引起了广泛关注[20]。最近的进展进一步强调了催化活性调节、特异性工程和集成样品预处理策略[21] [22] [23]。基于纳米酶的策略也被用于肺癌相关生物标志物的检测。例如，已经开发了基于Tb-Cu MOF@Au纳米酶的生物传感器，通过光电化学/荧光双重模式分析来检测NSE[24]。此外，还有报道使用比色辅助的光电化学平台进行NSE的双模式检测[25]。基于荧光的纳米探针也实现了NSE和ProGRP的同时分析[11]。与天然酶相比，纳米酶标签通常更稳定，更容易与信号放大系统集成。在各种纳米酶标签中，含Pt的纳米结构特别有吸引力，因为富含Pt的表面可以有效地促进H₂O₂的活化并加速发色底物（如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的氧化[26] [27] [28]。除了催化放大外，磁分离和图像辅助读数对于临床血清生物标志物分析也至关重要[29] [30] [31]。基于磁珠的亲和捕获技术能够有效富集目标结合复合物，并减少复杂生物基质中的非特异性背景[32]。比色测定方法本质上适合肉眼观察，而智能手机成像和基于RGB的特征提取可以在没有复杂仪器的情况下将颜色变化转换为定量信号[33] [34] [35] [36]。相比之下，本研究结合了磁分离、Au@Pt介导的比色信号生成和基于智能手机的RGB定量，用于并行测定血清中的NSE和ProGRP，提供了一种灵敏且直观的血清生物标志物测定方法。

在这里，我们开发了一种基于纳米酶的双目标比色免疫测定方法，用于并行测定血清中的NSE和ProGRP。使用Au@Pt纳米粒子作为模仿过氧化物酶的催化标签，并结合基于磁珠的夹心免疫识别和基于智能手机的RGB分析（图1）。磁珠经过捕获抗体的功能化处理，构建了用于NSE和ProGRP的夹心免疫测定。磁分离后，捕获的Au@Pt标签催化了TMB-H₂O₂的发色反应，通过迷你程序辅助的RGBgreen分析对产生的比色响应进行了定量。通过发色测定和稳态动力学分析评估了Au@Pt的催化性能，同时使用密度泛函理论（DFT）计算研究了H₂O₂在Au和Au@Pt表面上的活化情况。该测定方法对这两种生物标志物都具有宽检测范围和低检测限。进一步分析了来自健康对照组（HC）、SCLC和非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床血清样本，以评估实际样本的适用性和SCLC的鉴别能力。与之前报道的采用电化学检测[37]、免疫捕获LC-MS/MS[38]或荧光读数[11]的双生物标志物测定方法不同，本方法结合了两种生物标志物的并行测量，并使用了来自HC、SCLC和NSCLC组的血清样本进行评估。这项工作建立了一种集成了磁分离、纳米酶辅助的信号放大和基于智能手机的定量读数的比色免疫测定方法，用于并行测定血清生物标志物。

章节片段

材料与仪器

实验中使用的商业化学品、抗体、重组抗原、羧基化磁珠（MBs）和牛血清白蛋白（BSA）均按原样使用，整个实验过程中使用了超纯水。关于试剂来源、仪器型号、表征条件和图像分析程序的详细信息见支持材料。

Au@Pt纳米粒子的合成

通过在HAuCl₄中加入三钠柠檬酸盐进行还原来合成Au种子纳米粒子。简而言之，将HAuCl₄溶液加热至沸点，随后...

双目标比色免疫测定的工作原理

所提出的双目标比色免疫测定方法旨在特异性且并行地检测与SCLC相关的两种血清生物标志物NSE和ProGRP。该测定方法结合了磁分离、Au@Pt纳米酶介导的催化放大和基于RGB的光学读数。与天然酶相比，纳米酶标签在生物分析传感中具有催化信号放大、可调表面化学性质和更好的稳定性[39] [40]。

结论

总之，我们开发了一种基于纳米酶的双目标比色免疫测定方法，用于并行测定血清中的NSE和ProGRP。通过结合基于磁珠的夹心免疫识别、Au@Pt纳米酶介导的催化放大和迷你程序辅助的RGBgreen分析，该测定方法将生物标志物依赖的免疫复合物的形成转化为可视化且可量化的信号。Au@Pt对TMB-H₂O₂系统的催化性能得到了...

CRediT作者贡献声明

王玉环：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、正式分析、数据管理、概念构思。杨慧凡：验证、软件、研究、资金获取、数据管理。黄一丹：验证、软件、方法学、正式分析、数据管理。邵向阳：撰写——原始草稿、验证、资源获取、正式分析、概念构思。郝俊星：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、验证

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22476044、22276065和22306056）、湖北省自然科学基金（2026AFB766）、武汉自然科学基金（2025041001010351）以及湖北省健康与 wellness 科技项目（WJ2025Q068）的支持。

王玉环|杨慧凡|黄一丹|邵向阳|郝俊星|吴康宾