基于阳离子与中性双链表面活性剂混合物选择毛细管电泳蛋白质分离的最佳毛细管涂层

《Analytica Chimica Acta》：Choosing the best capillary coatings based on mixtures of cationic and neutral double-chained surfactants for protein separation by capillary electrophoresis

　　

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  DSPC/DODAB涂层降低了电渗流（EOF），提高了分辨率和重复性
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  DSPC/DODAB涂层的分离效率优于POE40硬脂酸酯/DODAB
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  添加POE40硬脂酸酯降低了电渗流，但增加了峰展宽
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  为酸性条件下蛋白质毛细管电泳选择毛细管涂层提供了图形化指南

引言

峰分离效率是毛细管电泳（CE）中的关键参数[1]，特别是在优化蛋白质分离的分辨率时尤为重要[2]、[3]。峰的色散通常用塔板高度表示，其有三个主要的加和贡献项[4]、[5]：$$$$其中D为扩散系数，u为溶质流速，p为曲线上升部分的斜率，cst为常数。首先，轴向扩散的贡献是一种内在限制，由分析物的扩散系数决定，并以1/u的比例变化。柱上效应是由进样、检测和毛细管盘绕引起的常数项，它们不依赖于分析物的流速，因此也不依赖于分析物的迁移时间和施加的电压。最后，动力学效应对H的贡献与u成正比[6]、[7]，通过p项体现。p考虑了分析物在毛细管壁上的吸附以及沿毛细管表面的表面电荷不均匀性（SCI）[5]。虽然通过用各种中性或带电涂层修饰毛细管表面可以限制甚至抑制吸附[5]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]，但减少电渗流（EOF）的不均匀性仍然极具挑战性。SCI会产生不均匀的局部电渗流速度，伴随弥散性的流体动力学贡献，从而强烈扭曲理论上平坦的电渗流轮廓[5]。即使非常微小的表面电荷缺陷也能导致严重的峰展宽，使H-u曲线具有高的p值[5]。

对于由聚二烯丙基二甲基氯化铵和聚苯乙烯磺酸钠（PDADMAC-PSS）_2.5形成的5层阳离子聚电解质涂层，p值在60 cm长毛细管上通常在2至15毫秒的范围内，具体取决于所研究的蛋白质（碳酸酐酶（CA）、肌红蛋白（Myo）、核糖核酸酶A（RNAse A）、β-乳球蛋白A（β-lac A）或溶菌酶（Lyz）），平均p值为5.64 ± 5.45毫秒[10]。对于中性聚合物涂层，在相同毛细管长度和相同蛋白质的条件下，p值在1至13毫秒之间，具体取决于所研究的涂层类型（聚乙烯醇（PVA）、共价和物理吸附的聚环氧乙烷（PEO）、羟丙基纤维素（HPC）、线性聚丙烯酰胺（LPA）或μSILwax），平均p值为3.09 ± 3.05毫秒[10]。要进一步降低p值，需要使用均匀性更好、表面缺陷含量更低且几乎没有蛋白质吸附的涂层，因为吸附也可能导致（局部）电荷缺陷的产生。

双链阳离子表面活性剂涂层已展现出卓越的分离效率[13]、[14]、[15]。例如，二二十二烷基二甲基溴化铵（2C₁₂DAB或DDAB）、二甲基二硬脂基溴化铵（2C₁₄DAB）和二甲基二辛酰基溴化铵（2C₁₈DAB或DODAB）涂层产生的理论塔板数高达约100万块/m，且具有高度的迁移时间重复性（0.8–1.0% RSD）[13]、[15]。最近，我们发现DODAB涂层在减少表面电荷不均匀性方面显著优于SMILs[10]。事实上，H-u图显示，DODAB涂层在25 μm I.D. × 80 cm毛细管上进行蛋白质分离时，平均p值为0.85 ± 0.28毫秒[16]，这表明自组装表面活性剂双层膜创造了比SMILs聚电解质层更平坦、更均匀和更有组织的表面[5]。

在我们之前的工作中[16]，我们优化了DODAB涂层的制备工艺。发现了关键参数，包括温度、超声处理、缓冲液性质、涂层溶液的pH和浓度，以及毛细管内径（I.D.）。最优实验条件确定为：在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 3.0）中使用0.1 mM DODAB，通过60 °C的超声/搅拌法制备，毛细管I.D.为25 μm。这些条件在使用2 M乙酸（AcOH）作为挥发性背景电解质（BGE）时，提供了极高的分离效率（对溶菌酶最高达606,000 ± 27,000块/m）和出色的重复性（迁移时间RSD = 0.21%）。然而，高密度的表面正电荷产生了强阳极电渗流（约-78 TU，其中1 TU表示Tiselius单位 = 1 × 10^-9 m²V^-1s^-1），这严重限制了蛋白质之间的分辨率。因此，调节DODAB涂层的电渗流淌度对于将高分离效率与可调选择性相结合至关重要，从而在合理的分析时间内实现适当的峰分辨率[17]。

迄今为止，已提出多种策略来调节双链表面活性剂涂层的电渗流。这些策略包括：(i) 与中性聚合物进行共同涂层，如聚氧乙烯40硬脂酸酯（POE 40硬脂酸酯），采用混合或顺序方法，可显著降低电渗流[18]、[19]、[20]；(ii) 形成混合双层膜，将DDAB等阳离子表面活性剂与两性离子脂质（如1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或DLPC）混合，以减少净表面电荷密度[21]；以及(iii) pH介导的调节，但这通常受到涂层在pH > 7时的不稳定性或可降解性的限制[20]。

本研究的目的是通过在酸性条件下同时实现高表观选择性和分离效率，来降低DODAB涂层的电渗流并提高蛋白质的分辨率。本研究并非引入新的涂层，其贡献在于系统比较两种先前已报道的涂层概念。首先，通过将两性离子脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或DSPC）掺入混合双层膜方法中进行考察。其次，评估了使用中性POE 40硬脂酸酯聚合物的顺序共涂层方法[20]。涂层的优化通过系统地研究涂层的动力学行为（H-u曲线）来完成。文中提出了图形化指南来优化分辨率，并根据蛋白质的有效淌度选择最合适的阳离子或中性毛细管涂层。

章节摘要

化学品

乙酸（AcOH，纯度99.8%）、磷酸氢二钠二水合物（纯度≥ 99%）和氢氧化钠（NaOH，纯度≥ 98%）由Honeywell-Fluka（德国，赛尔策）供应。磷酸（纯度85%）购自Prolabo（法国，巴黎）。甲醇（MeOH）购自Carlo Erba（法国，瓦勒德赖）。二甲基二辛酰基溴化铵（DODAB，纯度≥ 99%）购自Acros Organics（比利时，赫勒）。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC，纯度≥ 99%

结果与讨论

DODAB是一种双链阳离子表面活性剂，包含带正电的季铵头基和两条饱和的18碳烃尾部（见图1A）。DODAB的凝胶-液晶相变温度（T_m）约为45 °C，在分散于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 3.0）中时，自组装成直径约300 nm的囊泡。吸附到毛细管表面后，可获得光滑均匀的DODAB涂层。然而，高密度

结论

在本研究中，基于5种蛋白质、5种电压、每种毛细管涂层重复5次，系统地研究了修饰DODAB涂层的动力学行为。这代表了约550次进样、约10 m毛细管、约250小时的分析时间（不包括冲洗和涂层制备）以及约2750个峰的积分的大量实验集合。DODAB涂层产生的强阳极电渗流（?77.8 ± 0.8 TU）通过添加DSPC得以调节，导致弱

CRediT作者贡献声明

Laurent Leclercq： 写作——审阅与编辑、验证、监督、软件、资源、项目管理、方法论、调查、形式化分析、数据整理、概念化。Chirapha Prakobdi： 写作——原始草稿、软件、方法论、调查。Hervé Cottet： 写作——审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式化分析、数据整理、概念化。Phoonthawee Saetear：

未引用参考文献

[34]、[35]。

利益冲突声明

? 作者声明他们不存在可能影响本论文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢法泰合作项目（Campus France）对C.P.提供的部分博士生奖学金资助。

Chirapha Prakobdi|Laurent Leclercq|Phoonthawee Saetear|Hervé Cottet