利用自动化定量成像技术高通量重新评估钙结合荧光蛋白水母荧光素酶的金属离子特异性

《Analytical Biochemistry》：High-throughput reevaluation of metal ion specificity in the Ca2+-binding photoprotein aequorin using automated quantitative imaging

　　

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  对重组水母素响应29种金属离子的反应进行了定量表征
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  发光反应通过自动化高通量成像系统进行了解析
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  金属离子诱导的发光被分为六种不同的响应类别
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  闪光型和余辉型发光指示不同的金属离子作用模式
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  金属离子特异性反映了不同的EF-hand相互作用和构象变化

引言

水母素是一种钙结合发光蛋白（约25 kDa），最初从发光水母 Aequorea aequorea（= A. victoria）中分离获得，由Shimomura及其同事于1962年首次报道[1]。当加入过量Ca²⁺时，水母素会发出最大吸收峰约460 nm的蓝色闪光并迅速衰减，同时生成水母素醛和CO₂。由于水母素对10^-7–10^-3 M浓度范围内的Ca²⁺敏感，它已被用作活体和离体环境中钙检测的探针 2, 3。

在发光反应之后，水母素转化为蓝色荧光蛋白（BFP），即Ca²⁺结合的水母素原蛋白（水母素的脱辅基蛋白）与水母素醛的复合物，其发射光谱与水母素相同 4, 5（图1）。BFP可与水母素醛素（荧光素）共孵育，在还原剂（如2-巯基乙醇和二硫苏糖醇）和螯合剂（如EDTA和EGTA）存在下再生为有活性的水母素[6]（图1）。从脱辅基蛋白到水母素的再生过程类似于酶-底物中间体的形成，BFP可类比为酶-产物复合物。

水母素的一级结构于1985年通过cDNA的分子克隆（GenBank登录号L29571）[7]和水母素的直接氨基酸测序[8]确定。水母素由189个氨基酸残基组成（21.4 kDa），含有三个共识EF-hand基序作为Ca²⁺结合位点 9, 10。此外，还鉴定了多种水母素异构型 8, 11, 12。重组水母素是从在大肠杆菌细胞中表达的脱辅基水母素原蛋白出发，在二硫苏糖醇和EDTA存在下与水母素醛素共孵育制备的 13, 14, 15。

2000年，重组水母素的晶体结构被测定（PDB ID: 1EJ3）[16]。结构显示水母素是脱辅基水母素原蛋白与2-（S）-过氧化水母素醛素（水母素醛素在C2位的过氧化物）的非共价复合物，含有四个对应于EF-hand I–IV的螺旋-环-螺旋结构；然而第二个螺旋-环-螺旋结构（EF-hand II）已丧失了Ca²⁺结合能力[16]。

关于天然水母素发光反应中涉及的Ca²⁺离子数量的研究始于1970年代[2]。在1995至1996年间，对天然和重组水母素用Ca²⁺进行的发光滴定表明，水母素的发光发生在一个水母素分子结合两个Ca²⁺离子之后 17, 18。此外，使用Ca²⁺敏感电极进行的滴定表明，重组水母素结合三个Ca²⁺离子而非两个Ca²⁺离子[18]。因此，三个Ca²⁺离子与水母素的结合与水母素的晶体结构数据一致[16]。这些结果表明，两个Ca²⁺离子的结合是触发水母素发光反应所必需的，而结合了两个Ca²⁺离子的水母素会自发发光。水母素/2Ca²⁺复合物中剩余的Ca²⁺结合位点可以结合第三个Ca²⁺离子形成BFP（图1）。

另一方面，水母素在发光反应中的金属离子特异性分别由两个研究小组于1972年[19]和1973年[20]进行了报道。然而，除Ca²⁺外，两项研究之间观察到一些差异。因此，水母素的金属离子特异性仍未被完全阐明。

在本研究中，在这些最初报道发表50多年后，我们使用FDSS-μCELL? v2——一种配备集成分配系统和高度灵敏的CMOS（互补金属氧化物半导体）图像传感器的自动化成像系统，在384孔板格式下重新评估了水母素的金属离子特异性。

章节摘要

化学试剂

化学试剂从以下商业来源获得：三(羟甲基)氨基甲烷（Tris；和光纯药工业株式会社，日本大阪；货号207-06275），(±)-二硫苏糖醇（DTT；和光纯药；货号041-08976），硫酸铵（(NH₄)₂SO₄；和光纯药；货号019-03435），以及乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA；多津堂株式会社，日本熊本；货号345-01865）。使用牛血清白蛋白（BSA，V级；Sigma公司；货号A3059-100G）。水母素醛素（Mw =

使用FDSS-μCELL? v2系统测定金属离子（10^-8–10^-3 M）触发的水母素发光活性

为了表征水母素的金属离子特异性，关于发光强度、发光动力学和发光总回收量的信息对于理解水母素的发光过程具有重要价值。为此，采用了一种在384孔板中配备集成分配系统和高度灵敏CMOS图像传感器的自动化成像系统。

首先，将不同浓度的金属离子溶液（10 μL，2 × 10^-8至2 × 10^-3 M）注入

结论

在本研究中，我们使用自动化高通量成像系统在统一实验条件下，系统地表征了重组水母素对29种金属离子（终浓度10^-8至10^-3 M）的发光响应。通过对发光强度、动力学和发光活性回收的同步分析，发现金属离子诱导的响应可根据其发光特性和对水母素的影响分为六种不同的类别

CRediT作者贡献声明

久田直夫：撰写——审阅与编辑，验证，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理。中津 彻：撰写——审阅与编辑，数据管理。井上 聪：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，指导，项目管理，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理，概念构思

利益冲突声明

作者声明以下利益冲突：久田直夫是滨松光子株式会社的员工。井上聪和中津彻声明他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢M. Moriguchi博士制备50 mM金属离子储备液，感谢S. Yokawa博士和T. Suzuki博士制备水母素稀释液和金属稀释缓冲液。本研究部分由日本学术振兴会（JSPS）科研费资助 编号19H05780和25K22335（TN）。

Satoshi Inouye|Toru Nakatsu|Sunao Hisada