循环水养殖系统中三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）对不同养殖密度的生理与转录组响应研究

《Genes》：Physiological and Transcriptomic Responses of Triploid Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) to Different Stocking Densities in a Recirculating Aquaculture System

　　

专业术语翻译 背景/目的：养殖密度水平是调节循环水养殖系统（RAS）中鱼类生长性能和生理稳态的关键因素。方法：本研究设计了为期8周的饲养试验，设置30、50和70 kg/m3三个密度梯度，旨在系统研究三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的生长速率、消化功能、抗氧化状态和肝脏转录谱的变化。结果：所有处理组均保持了生长活力，最终体重和体长无显著差异。30G、50G和70G组的最终养殖密度分别为36.85 ± 0.73、59.70 ± 2.73和70.97 ± 0.32 kg/m3。然而，存活率随养殖密度增加而下降。消化酶活性在50 kg/m3时普遍较高，但在70 kg/m3时下降，尤其是肠道淀粉酶和胰蛋白酶活性。肝脏丙二醛（MDA）含量随养殖密度增加而升高，在70 kg/m3时达到5.47 ± 0.28 nmol/mg蛋白，而总抗氧化能力（T-AOC）显著下降至25.00 ± 1.52 μmol/g蛋白（p < 0.05），表明氧化应激增强和抗氧化防御减弱。在高养殖密度下还观察到轻度肝细胞空泡化。转录组分析在30 kg/m3组和70 kg/m3组之间鉴定出558个差异表达基因（DEGs）；这些基因主要富集于外源物质代谢、铁死亡和细胞黏附分子相关通路（p < 0.05）。在70 kg/m3时，多个抗氧化相关基因如cat、gclc、gsr、gpx1、gpx4a、prdx1和hsp70下调，而sod1、sod2、maf、me1和gadd45a上调。结论：这些结果表明，在本试验的RAS条件下，虹鳟在高达70 kg/m3的养殖密度下仍能维持生长，但较高密度与消化能力下降和肝脏氧化应激加剧相关。50 kg/m3处理组在生长、消化功能和抗氧化状态之间表现出相对有利的平衡，提示其可能适合RAS集约化生产。

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一、研究背景与意义

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是冷水性水产养殖中的重要经济物种，兼具生长快速和肉质优良的双重优势，全球商业价值持续上升。虹鳟于1959年引入中国后，已成为国内冷水性水产养殖的重要品种。尽管近年来国内产量有所增加，但进口仍是中国市场的重要供应来源，凸显了进一步提升国内虹鳟养殖生产力和效率的必要性。然而，集约化生产需要在最大化产量与维持鱼类健康和福利之间取得平衡，因此确定既能提高生产效率又不会造成过度生理应激的养殖管理策略，对虹鳟养殖的可持续发展至关重要。

循环水养殖系统（RAS）因其高水资源利用效率、减少环境影响以及在受控条件下进行集约化生产的能力，已成为最具前景的水产养殖技术之一。这些特性使RAS特别适合高密度养殖。然而，集约化的效益取决于系统维持充足溶解氧、去除悬浮固体和控制含氮废物的能力。随着养殖密度增加，鱼类耗氧量和代谢废物产生量通常上升，对增氧、水处理及生物过滤的运行需求增加。若系统处理能力不足，溶解氧可能下降，氨或亚硝酸盐可能积累，从而损害养殖环境。因此，养殖密度的评估不仅要考虑产量，还需结合系统性能和养殖鱼类的生理状况。

高养殖密度还可通过增加竞争、拥挤相关应激和能量分配改变直接影响鱼类，可能对生长、免疫、代谢和抗氧化防御产生后果。已有研究表明，高养殖密度显著抑制尼罗罗非鱼的生长性能，伴随炎症相关基因上调和胰岛素样生长因子-I下调；在真鲷中，高养殖密度促进氨和亚硝酸盐积累，导致免疫功能受损、丙二醛水平升高以及抗氧化酶活性的适应性改变。在虹鳟中，长期高密度应激不仅降低生长性能和饲料效率，还扰乱肝脏脂质代谢。尽管对虹鳟集约化生产的兴趣日益增长，但三倍体虹鳟在RAS条件下对不同养殖密度的生理和分子响应仍未得到充分表征。特别是，生长性能、消化能力、肝脏抗氧化状态和肝脏形态是否随密度增加而一致变化，以及与氧化应激相关的分子变化是否在可检测的生长抑制之前出现，仍不清楚。此外，三倍体虹鳟肝脏对不同养殖密度响应的转录组通路有待深入研究。

二、研究内容与主要结论

为解决上述问题，研究人员在RAS中开展了为期8周的饲养试验，设置30、50和70 kg/m³三个养殖密度处理，系统评估了三倍体虹鳟的生长性能、消化酶活性、肝脏抗氧化状态、肝脏组织学及肝脏基因表达。研究结果表明，虹鳟在30至70 kg/m³的密度范围内表现出相对稳定的生长模式，最终体重和体长在各组间无显著差异。然而，存活率随养殖密度增加而显著下降。在70 kg/m³组中，观察到MDA水平升高、CAT活性和T-AOC水平下降，表明抗氧化能力减弱，并伴随轻度肝脏组织学改变。转录组分析进一步揭示了与氧化应激、谷胱甘肽代谢、免疫调节和细胞应激反应（包括铁死亡相关过程）相关的基因和通路改变。这些结果提示，尽管虹鳟在本试验RAS条件下可在高密度下维持生长，但生理和分子应激随密度增加而加剧，尤其在70 kg/m³时。50 kg/m³处理组在生长、消化功能和抗氧化状态之间表现出相对有利的平衡，提示其可能适合RAS集约化生产。该研究为优化三倍体虹鳟RAS养殖密度提供了科学依据。

三、主要技术方法

本研究使用了以下关键技术方法：实验采用RAS系统，包含九个独立养殖单元，每单元水体体积为0.11 m³，各单元配备独立的循环回路和水处理组件。实验鱼为513尾三倍体虹鳟，初始平均体重95.15 ± 9.94 g，来源于黑龙江水产研究所渤海冷水鱼实验站。设置了30、50和70 kg/m³三个密度处理，每处理三个重复 tanks，分别分配102、171和240尾鱼。生长性能通过特定生长率（SGR）、条件因子（CF）、内脏体指数（VSI）、肝体指数（HSI）、存活率（SR）和饲料转化率（FCR）评估。消化酶活性测定包括淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶。氧化应激指标测定包括总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）。肝脏组织学采用苏木精-伊红（H&E）染色观察。转录组分析采用Illumina NovaSeq X Plus平台进行PE150双端测序，以虹鳟参考基因组（USDA_OmykA_1.1）为比对参考，使用DESeq2进行差异表达分析，clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析。qRT-PCR用于验证RNA-seq结果。

四、研究结果

4.1 生长性能。 经过8周饲养试验，所有处理组均观察到体重和体长的明显增长。最终体重和体长随养殖密度增加呈下降趋势，但组间差异不显著。SGR、CF、VSI和HSI在各组间无显著差异。然而，存活率随养殖密度增加而显著下降。最终养殖密度分别为36.85 ± 0.73、59.70 ± 2.73和70.97 ± 0.32 kg/m³。

4.2 肌肉常规营养成分。 各组间水分含量、粗脂肪含量和灰分含量无显著差异。粗蛋白含量在组间差异显著，50 kg/m³组最高（20.62% ± 0.81%），显著高于70 kg/m³组。

4.3 消化酶活性。 肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性在不同密度处理间存在显著差异。胃淀粉酶活性高于肠道淀粉酶活性，在50 kg/m³组达到峰值，随后在70 kg/m³组显著下降。总体而言，消化酶活性从30到50 kg/m³普遍升高，但在70 kg/m³时下降。

4.4 氧化应激相关参数。 CAT活性随养殖密度增加而显著下降，30 kg/m³组最高。SOD活性在50 kg/m³组出现显著峰值，超过30和70 kg/m³组。MDA含量随养殖密度增加而显著升高，在70 kg/m³组达到最大值。T-AOC水平在70 kg/m³组显著低于30和50 kg/m³组。

4.5 肝脏组织学。 H&E染色显示所有组肝脏基本结构完整。30 kg/m³组肝细胞排列规则，细胞边界清晰，仅少量胞质空泡。50 kg/m³组胞质空泡化更明显，肝细胞排列略不紧密。70 kg/m³组肝细胞出现轻度紊乱和更明显的胞质空泡化，伴随肝血窦轻度扩张。未检测到明显的核固缩、核溶解或组织坏死。

4.6 肝脏转录组分析。 差异表达分析显示，30G vs. 50G、30G vs. 70G和50G vs. 70G比较分别鉴定出678、558和499个DEGs。三个比较间共享的DEGs有限，表明不同密度间的转录响应存在差异。火山图分析显示，与30G相比，50G中有349个基因下调和329个基因上调；70G中有315个基因下调和243个基因上调。

4.7 氧化应激相关DEGs的富集分析。 KEGG富集分析显示，吞噬体通路在所有三个比较中均显著富集。30G vs. 50G比较中，DEGs富集于细胞色素P450介导的外源物质代谢、细胞黏附分子和PPAR信号通路。30G vs. 70G比较中，显著富集于外源物质代谢、铁死亡和细胞黏附分子通路。50G vs. 70G比较中，主要富集于MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、类固醇生物合成、钙信号通路等。GO富集分析显示，30G vs. 50G比较中DEGs富集于抗氧化活性、过氧化氢分解代谢过程和过氧化物酶活性；30G vs. 70G比较中主要富集于白细胞活化正调控和免疫球蛋白介导的免疫应答；50G vs. 70G比较中主要富集于细胞因子产生和免疫应答调控信号通路。

4.8 qRT-PCR验证。 选取7个氧化应激相关DEGs进行qRT-PCR验证。在50G vs. 30G和70G vs. 30G比较中，sod1和sod2上调，而cat、hsp70、gpx1、gsr和gpx4a下调，与RNA-seq结果方向一致。相关性分析显示RNA-seq和qRT-PCR的log₂ fold change呈正相关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，虹鳟在高达70 kg/m³的密度下仍能维持生长，可能部分反映了RAS控制水质的能力。然而，存活率随密度增加而下降，高密度组粗蛋白含量显著降低，提示慢性拥挤可能增加维持能量需求和应激反应的代谢成本。消化酶活性在50 kg/m³时升高而在70 kg/m³时下降，表明适度增加密度可能促进消化生理活动，而过高的密度可能损害消化功能。肝脏氧化应激指标显示，高密度组MDA升高、T-AOC和CAT活性下降，表明抗氧化系统逐渐受损。转录组分析揭示了与氧化应激、谷胱甘肽代谢、铁死亡和免疫调节相关的基因和通路改变。铁死亡通路的富集与MDA升高一致，提示长期高密度应激可能促进肝脏脂质过氧化并增加肝细胞损伤风险。

研究结论为：三倍体虹鳟在本试验RAS条件下，在30至70 kg/m³的养殖密度范围内表现出相对稳定的生长模式。然而，密度增加与存活率下降、消化酶活性受损和肝脏氧化应激加剧相关。在70 kg/m³时，观察到MDA水平升高、CAT和T-AOC水平下降，表明抗氧化能力减弱，并伴随轻度肝脏组织学改变。转录组分析进一步揭示了与氧化应激、谷胱甘肽代谢、免疫调节和细胞应激反应（包括铁死亡相关过程）相关的基因和通路改变。这些结果表明，尽管虹鳟在测试的RAS条件下可在高密度下维持生长，但生理和分子应激随密度增加而加剧，尤其在70 kg/m³时。在优化集约化RAS生产时，应同时使用生长性能和健康相关指标来评估养殖密度。