基于吡啶并[2,3-b]吡嗪的极性敏感探针：用于监测细胞应激下的脂滴动态及鉴别肺癌组织

《Analytica Chimica Acta》：Pyrido[2,3-b]pyrazine-Based Polarity-Sensitive Probes for Monitoring Lipid Droplet Dynamics under Cellular Stress and Discriminating Lung Cancer Tissue

　　

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  探针浓度低至 50 nM 即可用于细胞成像
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  铁死亡诱导的脂质自噬过程可视化
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  区分正常组织与癌症组织

Introduction

脂滴 (LDs) 是一种动态细胞器，由甘油三酯和胆固醇酯组成的中性脂质核心、磷脂单层以及特定蛋白质构成；其中性脂质核心几乎不含亲水基团。[1], [2], [3] 这种独特结构赋予脂滴极低的微环境极性，使其内部介电常数远低于其他富含脂质的区域。^[4] 脂滴长期以来被视为被动的脂质储存库，但最近的研究揭示它们在脂质代谢、信号转导以及氧化稳态调节中发挥着关键的调控作用。[5], [6], [7] 同时，脂滴稳态失衡与多种病理过程密切相关，特别是在程序性细胞死亡的调节以及恶性肿瘤的发生和发展中。[8], [9] 铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡过程。[10], [11] 在铁死亡过程中，脂滴充当多不饱和脂肪酸 (PUFAs) 的主要细胞储存库；通过脂质自噬依赖性降解，它们释放游离 PUFAs 以推动脂质过氧化级联反应并加速铁死亡。[12], [13] 此外，在肿瘤发生和发展过程中，癌细胞为了适应氧化应激并满足异常活跃增殖的需求，表现出显著的脂滴积累。在肺癌等实体瘤中，由代谢重编程驱动的异常进一步导致大量脂滴积累，为肿瘤增殖、转移和耐药提供了能量基础。[14], [15], [16] 鉴于脂滴在病理生理条件下复杂的动态行为，迫切需要有新型分子工具来可视化脂滴微环境的变化并追踪其时空命运。

荧光成像以其高时空分辨率和无创特性，已成为研究各种细胞内细胞器的不可或缺的工具。[17], [18], [19] 近年来，开发了各种靶向脂滴的荧光探针来解析脂滴的结构和动态行为。Kong 等人^[20] 合成了一种响应脂滴微环境中次氯酸的 LDM 前体探针，该探针与脂滴膜蛋白结合，实现了活细胞中脂滴单层膜的超分辨率成像以及膜接触位点蛋白聚集参数的定量。Hernández-Juárez 等人^[21] 报道了一种基于能斯特分配机制的 AztecLD 探针，实现了斑马鱼体内脂滴动态的可视化以及由异常水通透性引起的水肿的活体监测。Wang 等人^[22] 开发了一系列结合免洗成像与高极性响应的 D-π-A 脂滴极性探针，追踪了病理过程中脂滴极性的波动，并实现了对小鼠非酒精性脂肪肝疾病的组织水平和体内成像诊断。然而，迄今为止报道的靶向脂滴荧光探针仍存在显著局限性。大多数现有靶向脂滴探针表现出对溶剂极性广泛梯度响应，缺乏明显的“开 - 关”荧光切换能力。此外，这些探针通常仅允许观察脂滴数量和形态的变化，无法实时监测药物刺激下脂滴之间的融合过程，也无法实时报告细胞应激过程中脂滴与其他细胞器（如溶酶体）之间的动态相互作用 (Table S1)。[23], [24], [25] 此外，极性探针的应用目前 largely 局限于细胞水平，现有的少数组织成像研究主要集中在小鼠脂肪肝或肿瘤模型上。近年来，该领域逐渐将荧光探针的应用扩展到人体组织切片。[26], [27], [28], [29], [30] 因此，开发结合脂滴靶向特异性、超高极性敏感度和适用于人组织切片的新型荧光探针仍然是该领域急需解决的关键挑战。

在本研究中，基于具有 LE/CT 机制的典型 D-π-A 分子骨架，设计并合成了两种新型靶向脂滴的极性响应荧光探针 1a-1b。两种探针在生理 pH 范围内均表现出稳定的荧光发射，且体内相关离子和氨基酸分子的干扰可忽略不计。1a-1b 为追踪脂滴的极性及其在各种应激条件下的动态变化提供了新工具。同时，本研究扩展了极性响应脂滴探针在组织水平上的应用。

Section snippets

Materials and methods

材料、设备、测试溶液制备、荧光量子产率测试、选择性、光稳定性、细胞毒性以及细胞和组织成像方法均见支持信息。

The general process of preparation 1a-1b

1a-1b 的一般制备过程。 将 3-甲基吡啶并 [2,3-b] 嘧啶 (1) (1.2 mmol)、哌啶 (0.4 mL) 和 2a-2b (1.0 mmol) 的混合物加入无水乙醇 (5 mL) 中。在氮气保护下，混合物于 80°C 下反应过夜。该反应

Design and synthesis

脂滴在脂质代谢、炎症信号传导和铁死亡调节中起着关键作用；因此，准确可视化其动态行为及局部极性微环境对于阐明其生理和病理功能至关重要。为克服这一挑战，基于 LE/CT 机制设计并构建了两种 D-π-A 型荧光探针 (1a-1b) (方案 1)。与常见的二元氮萘环骨架不同，该探针实现了出色的

Conclusions

本研究基于 LE/CT 机制设计并合成了两种 D-π-A 型靶向脂滴荧光探针 1a-1b。两种探针在低极性环境中均表现出显著增强的荧光，具有高灵敏度和良好的选择性，能够实时监测炎症、油酸和铁死亡刺激下脂滴极性和数量的动态变化。可视化铁死亡过程中脂滴与溶酶体之间的动态接触

CRediT authorship contribution statement

Xu Xu: 方法论、调查。Jian-Feng Ge: 方法论、构思。Hong-Di Xu: 撰写 - 初稿、方法论、调查、数据整理、构思。Long-Kun Li: 撰写 - 审阅与编辑、监督。Chang-Cun Yan: 撰写 - 审阅与编辑、监督。Ru Sun: 撰写 - 审阅与编辑、监督、资金获取

Conflicts of interest

没有利益冲突需要声明。

Data Availability

支持本文的数据已作为 ESI^? 的一部分包含在内。

Declaration of Competing Interest

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本文所述工作的结果。

Acknowledgements

本研究得到了江苏省高校优势学科建设工程 (PAPD)、国家自然科学基金 (批准号：22475144) 和苏州市科技基金 (SZM 2022014) 的资金支持；合成部分部分由台湾永光化学有限公司支持。

Hong-Di Xu|Long-Kun Li|Xu Xu|Jian-Feng Ge|Chang-Cun Yan|Ru Sun