基于HS-GC-MS、UPLC-QTOF-MS和HPLC-DAD的连翘花化学表征与质量评价

《Processes》：Chemical Characterization and Quality Evaluation of Forsythia suspensa Flowers Based on HS-GC-MS, UPLC-QTOF-MS and HPLC-DAD Analysis

　　

连翘（Forsythia suspensa）为药用和食用灌木，其果实为常用草药。连翘花（Forsythia suspensa flowers, FFs）具有显著的食用和药用潜力，但其化学成分与质量评价研究仍有限。本研究将顶空-气相色谱-质谱联用（headspace gas chromatography-mass spectrometry, HS-GC-MS）、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS）和高效液相色谱-二极管阵列检测（high-performance liquid chromatography-diode array detection, HPLC-DAD）相结合，用于FFs的化学表征和质量评价。HS-GC-MS用于表征挥发性成分并构建FFs指纹图谱。UPLC-QTOF-MS用于非挥发性成分的定性分析，并建立HPLC指纹图谱以评估FF样品的一致性。采用经过验证的HPLC-DAD方法测定FF样品中7种非挥发性成分（绿原酸、芦丁、连翘酯苷A、（+）-松脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘苷、槲皮素和连翘苷元）的含量。共表征44种挥发性化合物和32种非挥发性化合物。建立FF的HS-GC-MS和HPLC指纹图谱，并鉴定15种挥发性成分和7种非挥发性成分为共有峰。所建立的GC-MS和HPLC指纹图谱方法具有良好的专属性，可用于FF的质量评价。基于定量结果的化学计量学（chemometrics）分析显示，不同产区FF样品中非挥发性成分存在显著差异。本研究为FF的化学表征和质量评价提供了可靠方法和有用信息。进一步研究将聚焦FF及其活性成分的生物活性（biological activities），为其在制药和食品工业中的应用奠定基础。

研究背景与问题：连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）为广泛分布于东亚和欧洲的观赏灌木，其果实为著名传统中药，临床用于治疗发热、炎症、淋病、痈肿和丹毒等。除果实外，叶和花也具有食用和药用价值。连翘花（Forsythia suspensa flower, FF）常被制成保健花茶，在中国北方民间文化中有传统。现代植物化学研究显示FF富含多酚、黄酮、木脂素和三萜酸等生物活性成分，类型与连翘果实和叶相似；已确认含连翘酯苷A、芦丁、（+）-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside等。药理研究显示FF及其成分具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗高脂血症和神经保护等活性。然而，连翘主要药用部位为果实，为提果率农民疏花，导致大量FF废弃；中国主产区山西、河北、河南、山东每年疏花丢弃数千吨。现有研究多聚焦果实和叶的化学表征与质量控制，对FF全面化学表征和质量评价尚无研究和讨论，因此急需开展。研究人员采用多色谱分析综合表征和质量评价FF，建立挥发和非挥发指纹及定量方法；结论为共表征44种挥发性和32种非挥发性化合物，15种挥发性和7种非挥发性成分为共有峰，方法专属性好，不同产地非挥发性成分差异显著，为FF化学表征和质量评价提供可靠方法和信息，并为其在制药和食品工业应用奠定基础。

关键技术方法：研究纳入20批FF样品，采自中国4个主产区：山东S1–S3、河南S4–S7、山西S8–S16、河北S17–S20；2024年4月盛花期10天采收窗口采集，阴干，由Prof. Long Guo鉴定。方法包括HS-GC-MS分析挥发油并建立指纹图谱；UPLC-QTOF-MS正离子模式定性非挥发性成分；HPLC-DAD建立指纹图谱并定量7种非挥发性成分；采用相似度评价、层次聚类分析（hierarchical clustering analysis, HCA）、主成分分析（principal component analysis, PCA）和单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey检验进行统计分析。

研究结果：
3.1 基于HS-GC-MS的FF挥发性成分化学表征：通过HS-GC-MS分析FF挥发油，并与NIST 17质谱库比对，鉴定44种挥发性化合物，包括12种醛、11种烷、8种萜类、4种酮、4种酯、2种有机酸、1种醇、1种烯和1种酚；十四醛相对含量最高，为16.44%±6.94%，十一醛和十二醛分别为12.91%±6.50%和13.15%±5.02%；醛类最丰富，其次为烷类和萜类，挥发成分类型与连翘果实相似。
3.2 FF挥发性成分HS-GC-MS指纹图谱分析：20批FF样品建立对照指纹图谱，筛选15个共有峰，包括芳樟醇氧化物、壬醛、十一醛、十二醛、十五烷、十三醛、十六烷、十四醛、十七烷、十五醛、十六醛、六氢法尼基丙酮、法尼基丙酮、muscalure和二十三烷；相似度为0.706–0.971（除S10），提示不同产地FF挥发成分相似，但仍可能存在内部差异。
3.3 化学计量学分析：基于15个共有峰面积进行HCA，欧氏距离为15时样品分为4类，但除S8、S10和S20外其余样品聚为一类，不能按产地清晰区分；PCA结果相似，多数样品聚为一组，HCA和PCA均不能有效区分不同产地FF，挥发成分不足以用于不同产地FF的鉴别。
3.4 基于UPLC-QTOF-MS的FF非挥发性成分化学表征：采用正离子模式UPLC-QTOF-MS鉴定32种非挥发性成分，包括9种木脂素、8种黄酮、7种有机酸、6种苯乙醇苷、1种香豆素和1种其他化合物；其中7种与对照品明确鉴定，25种根据保留时间、精确分子质量和MS/MS碎片模式暂定鉴定；主要非挥发性成分为木脂素、黄酮和苯乙醇苷，与连翘果实相似，这些成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌和抗过敏等活性，提示FF具有开发潜力。
3.4.1 苯乙醇苷鉴定：初步鉴定6种苯乙醇苷，包括maoliunoside、forsythoside B、calceolarioside A、forsythoside A、calceolarioside B和acteoside；以连翘酯苷A为例，其分子式为C₂₉H₃₆O₁₅，前体离子为m/z 625.2119 [M+H]⁺，根据特征碎片和文献鉴定。
3.4.2 黄酮鉴定：初步鉴定8种黄酮，包括金丝桃苷、槲皮苷、芦丁、紫云英苷、异鼠李素、山奈酚、山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素；以芦丁为例，其前体离子为m/z 611.1629 [M+H]⁺，分子式为C₂₇H₃₀O₁₆，根据失糖、RDA重排及特征碎片鉴定。
3.4.3 有机酸鉴定：初步鉴定7种有机酸，包括对香豆酸、香草酸、3,4-二乙氧基苯甲酸、咖啡酸、奎宁酸、绿原酸和对香豆酰奎宁酸；以绿原酸为例，前体离子为m/z 355.1008 [M+H]⁺，根据酯键断裂产生的奎宁酸和咖啡酸碎片鉴定。
3.4.4 木脂素鉴定：初步鉴定9种木脂素，包括demethylphillyrin、pinoresinol-4-O-glucoside、arctigenin、(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside、epipinoresinol、phillyrin、arctiin、pinoresinol和phillygenin；以连翘苷为例，前体离子为m/z 557.1985 [M+Na]⁺，根据失糖和特征碎片鉴定。
3.5 FF非挥发性成分HPLC指纹图谱分析
3.5.1 HPLC条件优化：通过比较甲醇-水、乙腈-水、甲酸水等流动相、流速和柱温，确定乙腈-水甲酸梯度洗脱、柱温30 °C、流速0.3 mL/min时分离最佳。
3.5.2 HPLC指纹图谱分析：20批FF建立HPLC指纹图谱，选择7个共有峰，分别为绿原酸、芦丁、连翘酯苷A、(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside、phillyrin、quercetin和phillygenin；相似度为0.853–1.000，表明不同产地FF主要非挥发性成分相似；方法精密度、稳定性、重复性和准确性良好，可用于FF及其产品质量控制。
3.6 七种非挥发性成分定量分析
3.6.1 方法验证：7种成分线性良好，r²≥0.9992；定量限（limit of quantification, LOQ）为0.020–0.180 μg/mL，检出限（limit of detection, LOD）为0.013–0.110 μg/mL；日内和日间精密度相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）分别小于1.7%和2.6%，重复性RSD小于2.8%，稳定性RSD小于2.8%，回收率为99.20–103.13%，RSD小于2.7%，方法可靠。
3.6.2 七种非挥发性成分定量：20批FF中绿原酸、芦丁、连翘酯苷A、(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside、phillyrin、quercetin和phillygenin含量范围分别为1.12–6.29、20.95–51.38、12.25–46.89、1.93–44.70、3.28–9.31、0.19–1.45和0.24–5.79 mg/g；连翘酯苷A较丰富，芦丁和(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside也较丰富，为FF作为功能性膳食补充剂开发提供理论依据。
3.6.3 化学计量学分析：基于7种非挥发性成分含量进行HCA，欧氏距离为5时样品分为3类：山西和河北样品（S8–S20）为一类，河南样品（S4–S7）为第二类，山东样品（S1–S3）为第三类；PCA中第一主成分和第二主成分贡献率分别为88.8%和7.1%，累计解释95.9%总方差，R²X为0.959、Q²为0.852，分为三组，表明不同产地FF非挥发性成分存在差异；山东样品芦丁和连翘酯苷A显著低于山西、河南和河北样品，木脂素类(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside和phillyrin在山东和河南样品中较低，槲皮素在河北样品中较高、山东样品中最低（p < 0.05）。

讨论总结：挥发性成分在20批FF样品间高度相似，HCA和PCA不能按产地有效区分；非挥发性成分定量结果经HCA和PCA可分为山东、河南、山西与河北三组，表明不同产地FF非挥发性成分存在差异；建立的GC-MS和HPLC指纹图谱及HPLC-DAD定量方法专属性好、可靠，可用于FF质量评价。

研究结论（译）：本研究应用HS-GC-MS、UPLC-QTOF-MS和HPLC-DAD表征FF中挥发性和非挥发性成分。HS-GC-MS鉴定44种挥发性化合物，包括12种醛、11种烷、8种萜类、4种酮、4种酯、2种有机酸、1种醇和1种烯；UPLC-QTOF-MS表征32种非挥发性化合物，包括9种木脂素、8种黄酮、7种有机酸、6种苯乙醇苷、1种香豆素和1种其他化合物。进一步采用GC-MS指纹图谱和化学计量学评价比较不同产区FF挥发成分，结果显示FF样品间挥发成分变化不显著，不同产区FF挥发成分相似。建立HPLC指纹图谱评估FF非挥发性成分，鉴定7个共有峰，包括绿原酸、芦丁、连翘酯苷A、(+)-pinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside、phillyrin、quercetin和phillygenin；所建HPLC指纹图谱方法专属性好，可用于FF质量评价。采用经过验证的HPLC-DAD方法同时定量20批FF中7种化合物，定量和化学计量学结果显示不同产地FF非挥发性成分存在明显差异。总之，本研究为FF化学分析和质量评价提供可靠可信的分析方法，并为FF进一步开发利用提供基础化学证据；未来研究建议聚焦FF生物活性，以验证其在功能食品和制药领域的应用前景。