基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术创制携带靶向突变的皱纹盘鲍G0奠基者群体

《Aquaculture》：Generation of a G0 founder population carrying targeted mutations in the Pacific abalone Haliotis discus hannai based on CRISPR/Cas9 genome editing

本研究旨在建立一套技术流程，用于在皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）中创制携带靶向突变的G0奠基者群体。研究人员靶向了一个酪氨酸酶基因（tyrosinase）。尽管利用在其他腹足类动物中建立的显微注射程序可以相对容易地诱导基因组突变，但在后续的幼体培养、变态诱导、幼体饵料优化以及个体是否携带突变的鉴定等方面遇到了诸多挑战。通过解决这些难题，研究人员成功建立了一个包含98个幼鲍的G0奠基者群体，其壳长范围为4至10 mm。基因分型检测证实，来自相同实验的一部分经操作个体在靶位点携带突变。这项工作将为近期内开发双等位基因突变体奠定坚实基础。

一、研究背景与科学问题

基因组编辑技术，特别是以CRISPR/Cas9为核心的技术，已在多个领域得到广泛应用。在水产育种中，该技术能够精准靶向性状相关基因，从而实现对目标性状的直接改良，具有育种周期短、成本低等优势。然而，在软体动物中，基于基因组编辑的育种应用仍十分有限。这主要归因于以下几个瓶颈：将外源物质引入配子存在困难；大多数软体动物具有复杂的双相生活史，使得对经操作个体的长期培养极为困难。具体而言，获得靶向突变仅是第一步，后续还需获得可育活的幼体并分析突变表型，最终建立稳定遗传的双等位基因突变品系。由于G0个体通常是嵌合体，突变仅存在于部分细胞中，因此培育G0个体至性成熟并进行交配是获得双等位基因突变体的主要策略。然而，在软体动物中，尤其是经济物种，将G0个体培养至成体阶段面临巨大挑战。与鱼类或哺乳动物不同，许多软体动物（特别是水产养殖种类）经历多个微小的幼体阶段，对环境因素敏感，且变态过程常伴随高死亡率。此外，显微注射等劳动密集型技术产生的突变个体数量有限，进一步加剧了培养难度。因此，本研究的目的是建立一套技术工作流程，在皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）中创制携带靶向突变的G0群体，为后续建立双等位基因突变品系奠定基础。

二、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：

1. 1.
   CRISPR/Cas9显微注射：针对皱纹盘鲍的两个酪氨酸酶基因（Hdh-tyr1和Hdh-tyr2）设计并合成多种单链引导RNA（sgRNA），将其与Cas9蛋白共同注射到未受精卵母细胞中。
2. 2.
   个体化幼体培养体系：为解决少量突变幼体培养过程中的原生动物爆发和高死亡率问题，研究人员将每个幼体单独培养在24孔板的独立孔中。
3. 3.
   变态诱导时机优化：通过每日测试对照组幼体在不同日龄时的伽马氨基丁酸（GABA）诱导变态率，确定最佳诱导时间窗口，待对照组变态率超过90%后，立即对实验组进行诱导。
4. 4.
   纯化硅藻饵料制备：从潮间带岩石和鲍鱼养殖场采集藻类，通过连续稀释、培养和显微镜挑选，分离纯化出三种硅藻物种（隶属于Psammodictyon属和Halamphora属），用于喂养刚完成变态的稚鲍。
5. 5.
   个体水平基因分型：开发了一种快速简化的DNA提取方法，结合PCR扩增和直接测序或TA克隆测序，鉴定单个稚鲍是否携带靶向突变。

三、研究结果

1. 显微注射与后续幼体发育

研究表明，显微注射程序通常不影响胚胎发育。但卵母细胞质量是关键变量：高质量卵母细胞受精率和正常发育率高；中等质量卵母细胞中，注射组会出现约5-10%的早期卵裂异常和10-20%的幼体畸形；低质量卵母细胞则导致整个批次被废弃。大部分实验中获得的卵母细胞为中等质量。

2. CRISPR/Cas9注射诱导Hdh-tyr1和Hdh-tyr2突变**

研究人员通过直接测序PCR产物色谱图判断突变与否：突变样本在sgRNA靶位点内部开始出现重叠峰。通过测试不同sgRNA组合，确定了两个基因的最优组合（Hdh-tyr1为sg2+sg4；Hdh-tyr2为sg5+sg7）。对于Hdh-tyr1，注射组中超过80%的幼体发育正常，且正常与异常幼体中均检测到突变，表明该基因的破坏不引起明显发育缺陷。对于Hdh-tyr2，约50%的注射幼体发育异常，且突变仅存在于异常组中，表明该基因的破坏影响了正常发育。

3. 经操作幼体的培养

研究人员发现，早期培养中的少数幼体死亡会引发原生动物爆发，进而导致其他幼体大规模死亡。通过改用24孔板单独培养每个幼体，该方法极大地降低了死亡率，基本消除了原生动物的出现，使几乎所有幼体存活至变态诱导前。

4. 变态诱导

研究发现，不同批次的幼体达到“变态感受态”的时间点不同，导致在同一时间点施加诱导剂GABA时变态率差异巨大（从10%到超过90%）。通过每日测试对照组幼体的变态率，并在其超过90%时对实验组进行诱导，研究人员成功实现了高效同步的变态，多次试验中实验组变态率均超过90%。

5. 经操作稚鲍的饵料优化

初期使用混合藻类（含硅藻和丝状/分支大型藻）喂养，导致稚鲍摄食活性低、死亡率高。研究人员通过分离纯化获得了三种纯种硅藻，以此喂养后，稚鲍表现出活跃摄食、消化腺饱满、生长良好，一个月后壳长达1-1.5 mm。

6. 部分注射稚鲍在靶位点携带突变

通过对41个个体进行基因分型（其中26个获得可读序列），研究人员确认8个个体携带靶向突变。其中5个可通过直接测序明确判定，另3个经TA克隆测序验证。突变位点在不同批次间有所差异，多数情况下集中在sgRNA4靶区，但某一批次则更多出现在sgRNA2靶区。

7. 在皱纹盘鲍中成功创制Hdh-tyr1突变群体**

经过对各环节的方法优化，研究人员建立了一套稳定可行的技术流程，最终获得了98个Hdh-tyr1编辑的稚鲍，壳长范围4-10 mm。虽然未进行全面的表型分析，但持续观察未发现注射组与对照组之间存在明显的形态学变化。

四、讨论与结论

讨论部分总结：

本研究成功建立了适用于少量突变幼体的培养程序，并在皱纹盘鲍中创制了包含近100个个体的G0奠基者群体，这是迈向经济软体动物基因组编辑育种完整技术链条的重要一步。研究重点解决了三个方面的挑战：幼体培养体系的优化——个体化培养是防止原生动物爆发和降低死亡率的关键；变态诱导的优化——必须评估每批幼体的最佳诱导时间点，而非固定于某一天龄；稚鲍饵料的优化——纯化硅藻饵料确保了稚鲍的存活和快速生长。在基因型和表型方面，Hdh-tyr2的破坏强烈影响幼体贝壳发育，而Hdh-tyr1的作用尚不明确。同时，研究中观察到多sgRNA使用时突变偏向于其中一个靶位点，且大片段的缺失罕见，其原因有待进一步探究。

研究结论：

综上所述，研究人员成功在皱纹盘鲍中建立了一套涵盖基因组编辑、变态诱导、幼体/稚鲍培养和单一个体基因分型的技术工作流程。这项工作代表了在太平洋鲍鱼中初步创制了G0奠基者群体，为未来获得双等位基因突变体并评估其经济性状改良潜力奠定了基础。