《Aquaculture and Fisheries》：Inter-order transplanted rice field eel female germline stem cells differentiate into male meiotic spermatogenic cells in zebrafish
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生殖细胞移植（germ cell transplantation, GCT）依赖于高质量供体生殖干细胞（germline stem cells, GSCs）与适宜受体的建立。本研究构建了以黄鳝（Monopterus albus）雌性生殖干细胞（female g
生殖细胞移植（germ cell transplantation, GCT）依赖于高质量供体生殖干细胞（germline stem cells, GSCs）与适宜受体的建立。本研究构建了以黄鳝（Monopterus albus）雌性生殖干细胞（female germline stem cells, fGSCs）为供体、以生殖细胞缺陷斑马鱼（Danio rerio）为受体的跨目异种移植体系。研究人员通过Percoll密度梯度离心从幼鱼卵巢中富集供体fGSCs，并采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、碱性磷酸酶染色及Vasa/增殖细胞核抗原（PCNA）免疫荧光对其进行鉴定。通过dnd1吗啉代寡核苷酸（morpholino, MO）敲降Tg(piwil1:eGFP)胚胎，制备不育受体，随后将PKH26标记的供体细胞移植至性腺嵴附近。移植细胞存活、迁移并向受体性腺区域定植。至性成熟期，移植鱼呈现重塑的性腺结构，而dnd1敲降对照组仍基本保持生殖细胞缺陷状态。嵌合性腺中检测到黄鳝特异性生殖系转录本及Vasa阳性细胞，证实供体细胞的持续存在与整合。此外，经体外诱导后，嵌合性腺培养物表达黄鳝减数分裂基因dmc1和rec8，并呈现从精原细胞样至精子样阶段的渐进性形态变化。上述发现表明，黄鳝fGSCs能够在亲缘关系较远的硬骨鱼受体中持续存在、维持生殖系特性，并展现类雄性生殖细胞发育潜能，为黄鳝种质资源保存与代孕繁殖提供了基础。
一、研究背景与科学问题
黄鳝（Monopterus albus）是东亚和东南亚地区广泛养殖的重要经济淡水鱼类。然而，其苗种供应长期依赖野生资源，已难以满足日益增长的市场需求，成为产业可持续发展的主要制约因素。长期过度捕捞和人为活动加剧了不同地理种群间的基因交流，对黄鳝种质资源的遗传完整性和多样性构成潜在威胁。同时，黄鳝具有雌雄同体先雌后雄（protogynous hermaphroditism）的繁殖模式，繁殖效率相对较低，高质量配子获取受季节限制，进一步阻碍了人工繁殖和遗传改良。因此，开发高效的种质资源保存和代孕繁殖策略，对于保护遗传资源、提高育种效率及促进黄鳝养殖业可持续发展具有重要意义。
生殖细胞移植（germ cell transplantation, GCT）近年来已成为鱼类种质保存和代孕生产的有前景技术，其核心是将供体生殖干细胞（germline stem cells, GSCs）移植入受体性腺，供体细胞在受体性腺微环境支持下增殖、分化并完成配子发生，最终产生供体来源的功能性配子。利用小型、短世代受体生产大型或长世代供体物种配子，被认为是该技术最具前景的应用方向之一。然而，GCT效率高度依赖供体生殖细胞的质量、纯度和发育阶段。大多数硬骨鱼性腺组织由异质细胞群体组成，包括体细胞和不同发育阶段的生殖细胞，这使得高效分离和富集高质量生殖干细胞在技术上具有挑战性，供体细胞制备成为限制GCT可重复性和效率的主要瓶颈之一。
鉴于生殖干细胞的发育可塑性，移植的雌性生殖干细胞（female germline stem cells, fGSCs）能够根据受体性腺微环境分化为雌性或雄性生殖系。斑马鱼作为广泛使用的硬骨鱼模式生物，在GCT研究中常被用作受体物种。移植前通常通过dnd1敲降消除内源生殖细胞，产生生殖细胞缺陷受体，此类处理通常导致雄性化性腺发育并形成类雄性性腺结构，从而为供体细胞定植和发育提供稳定的性腺生态位。因此，从幼鱼个体分离fGSCs并移植入dnd1敲降的生殖细胞-free斑马鱼受体，代表了一种实用且经济有效的异种GCT策略。
二、研究内容与主要结论
本研究从幼年黄鳝卵巢中分离并富集fGSCs，将其移植入生殖细胞缺陷斑马鱼受体，系统评估了供体细胞迁移、长期性腺定植及受体性腺结构重塑，并通过物种特异性分子分析和体外诱导，评估移植fGSCs是否保留生殖系特性和发育能力，能否逐步向类雄性生殖细胞阶段分化。研究结果表明，黄鳝fGSCs能够在亲缘关系较远的硬骨鱼受体中持续存在、维持生殖系特性，并展现类雄性生殖细胞发育潜能，为黄鳝种质资源保存与代孕繁殖提供了基础。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法：从3月龄幼年黄鳝卵巢组织经胰蛋白酶消化获得单细胞悬液，通过40%和60%两步Percoll密度梯度离心富集fGSCs；利用dnd1吗啉代寡核苷酸（morpholino, MO）显微注射Tg(piwil1:eGFP)斑马鱼一细胞期胚胎制备生殖细胞缺陷受体；将PKH26标记的供体细胞通过腹腔注射移植至4天受精后天数（days post-fertilization, DPF）受体幼鱼性腺嵴附近；采用RT-PCR、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）染色、Vasa/增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）免疫荧光鉴定供体细胞；通过组织学苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色、Vasa免疫荧光和物种特异性RT-PCR分析嵌合性腺；利用全反式视黄酸（all-trans retinoic acid, ATRA）体外诱导嵌合性腺细胞分化。
四、研究结果
（一）黄鳝雌性生殖干细胞的分离与鉴定
研究人员从3月龄幼年黄鳝卵巢经酶解和Percoll密度梯度离心后，在40%与60%界面及60%层底部观察到明显细胞分层。RT-PCR结果显示，与肝脏和肾脏等体细胞组织相比，卵巢组织和Percoll富集细胞群特异性表达生殖系相关基因dnd1、vasa及干细胞标志基因gfra1b、nanos2，而卵巢体细胞标志基因cyp19a1a在富集的fGSC组分中表达相对较低。免疫荧光分析显示，分离细胞呈现强Vasa信号，且多数Vasa阳性细胞与PCNA共定位，表明该富集群体由活跃增殖的生殖细胞组成。上述结果证明40% Percoll富集群体具有雌性生殖干细胞的典型分子和细胞特征。
（二）供体黄鳝fGSCs体外原代培养
40% Percoll界面细胞在ESM2培养基中表现出强贴壁能力，培养过程中逐渐形成增殖性细胞群体，从第1天至第7天保持相对均匀形态并持续扩增。碱性磷酸酶（AP）染色显示培养细胞呈阳性信号，表明存在未分化生殖干细胞样群体。相比之下，60% Percoll组分细胞呈现成纤维细胞样、颗粒细胞样和类固醇生成细胞样等不同形态特征，AP阳性细胞较少且染色强度较弱。定量分析显示40% Percoll组分细胞在贴壁后经历初期适应阶段，随后在培养期间逐步扩增，因此被选用于后续移植实验。
（三）dnd1-MO制备生殖细胞缺陷斑马鱼受体
研究人员将dnd1吗啉代寡核苷酸（dnd1-MO）显微注射至Tg(piwil1:eGFP)斑马鱼一细胞期胚胎。在4天受精后天数（DPF），所有对照组胚胎（83/83）在假定性腺区域均检测到清晰的原生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）绿色荧光信号，而大多数dnd1-MO注射胚胎（102/114）在性腺区域完全丧失eGFP阳性细胞，未检测到PGC信号。结果表明dnd1敲降有效消除了内源PGCs，成功制备了生殖细胞缺陷斑马鱼受体。
（四）黄鳝fGSCs在不育斑马鱼受体中的迁移与定植
将PKH26标记的fGSCs移植入dnd1-MO处理斑马鱼受体腹腔性腺嵴附近区域后，共移植102尾受体。在移植后1、5和12天（days post-transplantation, DPT），存活率分别为92.2%、83.3%和74.5%，PKH26阳性迁移率分别为85.1%、62.4%和42.1%。时间序列荧光成像显示，移植后1天在注射部位附近检测到散在红色荧光信号；至5天，PKH26阳性细胞逐渐向性腺嵴迁移并形成小细胞团；至12天，供体来源荧光信号在性腺区域富集，沿性腺嵴观察到多个聚集细胞团。上述观察揭示了PKH26阳性信号从移植部位向假定性腺区域的时间依赖性再分布。
（五）供体来源生殖系嵌合斑马鱼性腺的重塑
组织学检查显示，dnd1-MO处理斑马鱼性腺基本缺失生殖细胞，野生型斑马鱼呈现包含精原细胞、精母细胞、精细胞和精子的正常生精结构。相比之下，移植受体呈现重塑的性腺结构，形态上与dnd1-MO对照组明显不同。移植受体和dnd1-MO处理斑马鱼均未观察到雌性特异性性腺特征，两组均未呈现卵巢样结构或可见卵母细胞发育，而野生型雌鱼显示典型卵巢形态并含有发育中的卵母细胞。
（六）嵌合性的分子与免疫荧光鉴定
物种特异性RT-PCR分析在嵌合斑马鱼性腺中检测到黄鳝特异性转录本，而野生型斑马鱼和dnd1-MO处理对照组中未检测到这些信号。同时，斑马鱼特异性性腺标志物在嵌合性腺中仍可检测到，证明供体来源与受体来源组织共存。Vasa免疫荧光染色显示，5个嵌合性腺样本中有2个检测到Vasa阳性信号，而5个dnd1-MO处理对照性腺均未检测到Vasa阳性细胞。在阳性嵌合样本中，性腺组织内观察到散在的Vasa阳性生殖细胞，证实黄鳝雌性生殖干细胞成功定植并整合入斑马鱼生殖系统。
（七）嵌合斑马鱼性腺的体外诱导与分子鉴定
体外诱导后，嵌合性腺细胞表现出增强的增殖活性和细胞聚集增加，而dnd1-MO性腺培养物以成纤维细胞样细胞为主，呈广泛旋涡状生长模式，几乎无发育分化迹象。物种特异性RT-PCR分析显示，黄鳝生殖系相关转录本Ma-nanos2和Ma-vasa在供体细胞及诱导前后的嵌合性腺中均被检测到，而在dnd1-MO性腺对照组中缺失。更重要的是，减数分裂相关基因Ma-dmc1和Ma-rec8在诱导后的嵌合性腺中被检测到，表明供体来源生殖细胞发生了进一步的发育进程。相比之下，斑马鱼生殖细胞标志基因Dr-dmc1和Dr-rec8主要在野生型斑马鱼精巢中检测到，而嵌合性腺中未检测到，证实诱导生殖细胞的供体特异性来源。时间进程观察显示，诱导后2天出现精原细胞样小岛状集落；5天细胞聚集增加并活跃增殖；7天起观察到精母细胞分化特征；9天出现精细胞样细胞并形成细胞质桥连接簇；11至12天出现具有部分鞭毛的未成熟精子样细胞；15天后形成显著三维结构；17天观察到典型精子样形态细胞，具有球形头部且无明显顶体结构。
五、讨论与结论
讨论部分指出，Percoll密度梯度离心有效富集了增殖性fGSC群体并减少卵巢体细胞污染，但因cyp19a1a表达未完全消除，所得群体应视为fGSC富集而非绝对均一。dnd1-MO介导的敲降为制备生殖细胞缺陷受体斑马鱼提供了可靠方法。供体与受体物种间的系统发育关系是影响GCT效率和结果的关键因素，本研究代表了跨目生殖细胞移植体系。尽管供体细胞在嵌合性腺中的丰度相对较低，可能与供体生殖细胞与受体性腺微环境之间的分子相容性不完全有关，但研究仍证实了黄鳝fGSCs在异源性腺微环境中的长期存留和发育可塑性。体外诱导实验表明供体来源生殖细胞保留了生殖系特性并呈现向类雄性生殖细胞阶段的渐进分化，但精子样形态不能证明功能性精子的产生，需进一步功能验证。研究局限性包括移植和长期定植效率未定量评估、RT-PCR使用混合性腺样本无法评估个体差异、以及未在体内获得供体来源功能性配子。
研究结论：本研究从幼年黄鳝卵巢中富集雌性生殖干细胞并移植入生殖细胞缺陷斑马鱼受体。PKH26阳性信号在移植后向假定性腺区域进行性再分布。在移植后5个月（months post-transplantation, MPT），移植受体性腺中检测到黄鳝特异性生殖系转录本和Vasa阳性细胞，支持供体相关生殖系细胞的长期存在。fGSC移植还与受体性腺结构重塑相关。体外诱导后，嵌合性腺培养物表达黄鳝减数分裂基因dmc1和rec8，并呈现与类雄性生殖细胞分化一致的渐进性形态变化。这些发现支持黄鳝fGSCs在亲缘关系较远的受体中的发育可塑性，但需进一步定量和功能验证以确定定植效率及产生成熟可育供体来源配子的能力。
