抗生物膜裂解性噬菌体vB_PdP-TS25感染美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（PDP）的生物学与基因组学特征解析

《Aquaculture Reports》：Biological and genomic characterization of an antibiofilm lytic bacteriophage infecting Photobacterium damselae subsp. piscicida

　　

摘要专业翻译 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（PDP）是光杆菌病的病原体，在全球海水养殖业中造成重大经济损失。尽管噬菌体已成为控制细菌性鱼类病原体的抗生素替代方案的有力候选，但感染PDP的噬菌体仍缺乏系统表征。本研究从韩国西海岸采集的贝类样本中分离到一株新型裂解性噬菌体vB_PdP-TS25，并对其生物学、基因组学及抗生物膜特性进行了表征。透射电子显微镜观察显示，vB_PdP-TS25具有二十面体衣壳和短的非收缩性尾部，符合类短尾噬菌体（podovirus）形态特征。该噬菌体对PDP表现出高效的裂解活性，潜伏期为60分钟，爆发量约为每感染细胞125个噬菌斑形成单位（PFU）。其在pH 5–10的宽泛范围内及高达37 °C的温度下均保持稳定。其基因组包含69,954 bp的线性双链DNA，编码88个预测开放阅读框（ORF）及1个tRNA基因。未鉴定到与抗菌素耐药性、毒力或溶原性相关的基因。比较基因组学、系统发育学及基因共享网络分析一致表明，vB_PdP-TS25属于未分类尾状病毒目（Caudoviricetes）的一个分化谱系，与其最近已知亲缘物种的基因组间相似性低于30%。该噬菌体还显著抑制PDP生物膜形成并瓦解已建立的成熟生物膜，可能通过两个预测的解聚酶相关蛋白的活性实现。这些发现拓展了当前对感染PDP噬菌体的认知，并为开发基于噬菌体的策略以控制水产养殖中光杆菌病奠定了基础。

论文解读

一、研究背景与问题

美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae, PD）是一种革兰氏阴性、嗜盐海洋细菌，广泛分布于沿海及海洋环境中，被认定为一种人兽共患病原体，可导致鱼类、海洋哺乳动物及人类严重感染。PD目前分为两个亚种：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（PDD）和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（PDP）。其中PDP是专性鱼类病原体，为光杆菌病（又称巴氏杆菌病）的病原，可导致欧洲海鲈、金头鲷、大菱鲆、日本黄尾鰤及岩鱼等重要经济养殖鱼类的高死亡率。感染鱼类出现全身性败血症、脾肿大及内脏器官肉芽肿性病变，常因外部体征有限而迅速死亡，给集约化养殖条件下的疾病早期临床检测带来困难。

PDP防控面临多重挑战。首先，PDP具有形成生物膜的能力，生物膜是由细胞外聚合物（EPS）基质包裹的表面附着微生物群落，可保护内部细胞免受环境压力和抗菌药物攻击，成为水产养殖系统中难以根除的持续感染源。其次，抗生素治疗和疫苗接种在田间应用中效果有限且不一致，PDP多重耐药性的扩散以及对抗菌药物残留的监管限制进一步收窄了可用的防控选项。

在此背景下，噬菌体因其严格的宿主特异性、感染位点自我增殖能力及对有益微生物群影响极小等优势，成为有吸引力的抗生素替代方案。值得注意的是，部分噬菌体编码细菌多糖降解酶——解聚酶，通常定位于尾纤维、尾刺或基板蛋白中，这些酶可通过降解EPS屏障、促进噬菌体接近宿主细胞，从而在清除生物膜相关细菌种群方面提供优于抗生素的机制优势。

然而，靶向PDP的噬菌体研究极为匮乏。目前已报道的感染PD的噬菌体绝大多数针对PDD亚种，包括Phage-I、Phda1、vB_Pd_PDCC-1和TEMp-D1等；而针对PDP的噬菌体仅有一株ΦPh5被报道，且该噬菌体仅进行了表型水平表征，其基因组和抗生物膜活性均未被研究。这一空白构成了开展本研究的核心动因。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员从韩国西海岸采集的贝类样本中分离获得一株新型裂解性PDP噬菌体vB_PdP-TS25，并对其进行了系统的生物学、基因组学及抗生物膜特性表征。主要关键技术方法包括：透射电子显微镜（TEM）形态学观察；斑点试验测定宿主谱；一步生长曲线测定感染动力学参数；pH及热稳定性试验评估环境稳定性；Illumina NovaSeq 6000平台全基因组测序与de novo组装；RAST服务器基因组注释；BLASTp、InterProScan等工具进行ORF及保守结构域鉴定；PhageTerm预测基因组末端及包装策略；DePP预测推定解聚酶；AlphaFold及Foldseek进行候选基因三级结构预测与结构同源比对；基于末端酶大亚基（TerL）氨基酸序列的BLASTp检索获取24个近缘噬菌体；vConTACT3基因共享网络分析；MAFFT比对与MEGA12最大似然法系统发育树构建；VICTOR全基因组系统发育分析；Clinker基因组共线性分析；VIRIDIC基因组间相似性计算；结晶紫（CV）染色法评估生物膜抑制与降解活性。样本来源为韩国西海岸采集的贝类样本。

三、研究结果

3.1 噬菌斑与病毒粒子形态：研究人员从韩国西海岸贝类样本中分离到一株感染PDP ATCC 51736?的噬菌体，经三轮纯化后获得高滴度裂解液。在宿主菌苔上观察到直径约1.5 mm的清晰噬菌斑。TEM显示该噬菌体具有直径66.7 ± 0.7 nm的二十面体头部和7.3 ± 0.8 nm的短非收缩性尾部，呈类短尾噬菌体形态，依据标准病毒命名系统命名为vB_PdP-TS25。

3.2 宿主谱：斑点试验结果显示该噬菌体对分离宿主具有高度特异性，仅在PDP ATCC 51736?上形成清晰裂解区；对3株PDP菌株（MABIK MI00003114、MABIK MI00005801、MABIK MI00005863）和1株PDD菌株（NG-1）形成混浊裂解区；对其余8株PD菌株无裂解活性。

3.3 溶菌动力学：在感染复数（MOI）为10时完全抑制宿主菌增殖；MOI为0.1和0.001时产生相似的抑菌效果。一步生长曲线显示潜伏期为60 min，随后为40 min的上升期，最终爆发量约为每感染细胞125.0 PFU。

3.4 环境稳定性：pH稳定性试验显示该噬菌体在pH 5.0–10.0范围内保持稳定，pH 4.0和11.0时感染力降低，pH ≤ 3.0和pH 12.0时完全丧失可检测感染力。热稳定性试验显示其在37 °C以下保持感染力，45 °C时部分失活，≥ 56 °C时完全灭活。

3.5 基因组基本特征：基因组为69,954 bp线性双链DNA，G+C含量42.6%，平均测序深度51,553×。PhageTerm预测264 bp直接末端重复（DTR），提示T7样DTR包装策略。Virfam分类将其归入Type 3（短尾噬菌体科），与形态学特征一致。基因组编码88个推定ORF（蛋白长度38–1235个氨基酸）和1个tRNA基因（Asn；反密码子GTT），编码密度93.2%。基因组呈模块化组织：正链ORF（坐标1–32,977）主要编码结构和包装功能，负链ORF（坐标33,010–68,672）主要编码DNA和RNA代谢功能。未鉴定到与抗生素耐药、毒力或溶原性相关的基因。88个ORF中有25个被功能注释到四个模块：头部和包装（包括末端酶小亚基和大亚基、门户蛋白、主要衣壳蛋白）、尾部、裂解（包括酰胺酶和内溶素）、DNA/RNA代谢（包括DNA聚合酶、DNA引发酶/解旋酶、RNA连接酶、核苷酸转移酶、RNA聚合酶）。ORF 10和ORF 19被预测具有解聚酶活性（DePP评分分别为0.95和0.94），其中ORF 19基于氨基酸序列同源性被注释为尾纤维蛋白。

3.6 比较基因组分析：BLASTn分析显示vB_PdP-TS25与GenBank现有序列的核苷酸相似性有限，最近匹配为弧菌噬菌体CHOED（71.6%一致性，33%覆盖率）。基于TerL氨基酸序列的BLASTp检索获得24个命中（E值< 1 × 10?1??），均属于未分类尾状病毒目成员。vConTACT3基因共享网络分析显示vB_PdP-TS25与24个查询噬菌体在尾状病毒目网络中形成独立簇，且仅与感染γ变形菌纲宿主的噬菌体（包括气单胞菌噬菌体1233和vB_AsaP_MQM1、弧菌噬菌体CHOED、假交替单胞菌噬菌体vB_PtuP_Slicky01）存在直接网络连接。基于TerL氨基酸序列和全基因组的系统发育分析均将vB_PdP-TS25置于包含气单胞菌噬菌体vB_AsaP_MQM1和1233、弧菌噬菌体CHOED及假交替单胞菌噬菌体vB_PtuP_Slicky01的亚支中，但两棵树内的分支模式存在差异：TerL树中vB_PdP-TS25与气单胞菌噬菌体关系最近，全基因组树中则与弧菌噬菌体CHOED最近。基因组共线性分析显示四个噬菌体均呈现模块化基因组结构，头部/包装和尾部相关基因编码于正链，DNA/RNA代谢基因主要编码于负链；头部和包装基因保守性最高（四个构成蛋白在四个噬菌体间均共享），尾部基因组成变异较大（仅一个蛋白在四个基因组间保守）。vB_PdP-TS25独有RNA连接酶（ORF 31）和厌氧核糖核苷三磷酸还原酶NrdD（ORF 49）。60个假定蛋白中35个为vB_PdP-TS25独有，14个在四个基因组间保守。VIRIDIC分析显示vB_PdP-TS25与弧菌噬菌体CHOED、气单胞菌噬菌体1233和vB_AsaP_MQM1的基因组间相似性分别为27.2%、19.0%和17.1%，均远低于国际病毒分类委员会（ICTV）70%的属划分阈值。

3.7 抗生物膜活性：PDP ATCC 51736?在48 h静态培养后生物膜OD???达0.79。生物膜预防试验中，vB_PdP-TS25在24和48 h均以剂量依赖方式抑制生物膜形成，最低浓度10? PFU/mL即产生显著抑制效果；最高浓度下24 h内将生物膜形成抑制至接近阴性对照水平。生物膜降解试验中，vB_PdP-TS25在所有测试浓度下均显著减少24 h龄预形成生物膜的生物量。

四、讨论与结论

讨论部分指出，vB_PdP-TS25的类短尾噬菌体形态与尾状病毒目短尾噬菌体的T7样颈部结构一致。其窄宿主谱虽可能限制广谱应用，但可降低破坏非靶标微生物群的风险，且PDD作为海洋生态系统天然成员，窄宿主谱具有生态安全性优势。对3株额外PDP菌株和1株PDD菌株的弱裂解活性提示感染性并非严格局限于分离宿主，噬菌体鸡尾酒制剂可能拓宽治疗覆盖范围。其潜伏期（60 min）与Phda1、Phage-I和ΦPh5相同，长于vB_Pd_PDCC-1（25 min）；爆发量（125 PFU/细胞）超过Phda1（19 PFU/细胞）和ΦPh5（70 PFU/细胞），但低于vB_Pd_PDCC-1（286 PFU/细胞）。pH 5–10和37 °C以下的稳定性与PDP暴发通常发生的条件（约25 °C水温、海水pH 7.5–8.5）兼容。基因组中未检测到抗生素耐药、毒力或溶原性相关基因，与裂解性生活方式一致，支持其适用于生物防治。系统发育和网络分析将其置于未分类尾状病毒目的分化谱系中，基因组间相似性低于属划分阈值，表明vB_PdP-TS25代表该谱系中一个此前未描述的属级分类单元。头部和包装基因的保守性与尾部基因的变异性符合尾状噬菌体的一般进化模式，尾部基因变异可能反映了该谱系对不同宿主的适应性。抗生物膜活性可能与其编码的两个推定解聚酶基因相关，但其解聚酶功能需生化验证。研究仅进行了体外评价且主要针对单一分离菌株，需进一步使用更多PDP菌株和鱼类攻毒试验验证其菌株覆盖范围和体内效力。

研究结论为：本研究分离并表征了裂解性噬菌体vB_PdP-TS25。该噬菌体具有短尾、类短尾噬菌体形态，宿主谱窄且主要限于分离宿主，在PDP暴发相关的pH和温度范围内保持稳定感染力。其69,954 bp线性双链DNA基因组缺乏与抗生素耐药、毒力和溶原性相关的基因，符合适用于生物防治的裂解性生活方式。系统发育、网络和基因组间相似性分析将其置于不含任何当前ICTV认定科成员的分化谱系中，基因组间相似性低于属划分阈值，表明vB_PdP-TS25代表尾状病毒目内一个此前未描述的分类群。该噬菌体还通过抑制生物膜形成和降解预形成生物膜表现出对PDP的抗生物膜活性，与预测解聚酶基因的存在一致。综合这些生物学和基因组学特征及观察到的体外抗生物膜活性，支持进一步评估vB_PdP-TS25作为潜在生物防治候选株。其宿主范围、效力和安全性应使用更多PDP菌株和受控鱼类攻毒试验加以验证。