《Aquaculture Reports》：FishCodonKit: A Python-based toolkit for automated codon usage bias analysis and visualization of aquatic organism CDS sequences
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密码子使用偏好（Codon Usage Bias, CUB）源于突变压力和自然选择，并与基因表达调控和分子进化密切相关。现有工具如CodonW、BCAWT和CodonU要么缺乏集成可视化功能，要么需要编程专业知识，这限制了水产养殖研究人员的使用。FishCod
密码子使用偏好（Codon Usage Bias, CUB）源于突变压力和自然选择，并与基因表达调控和分子进化密切相关。现有工具如CodonW、BCAWT和CodonU要么缺乏集成可视化功能，要么需要编程专业知识，这限制了水产养殖研究人员的使用。FishCodonKit（版本1.0）是一个用于水生生物编码序列（Coding Sequences, CDS）CUB分析的Python工具包。它整合了核苷酸组成统计与相对同义密码子使用度（Relative Synonymous Codon Usage, RSCU）、有效密码子数（Effective Number of Codons, ENC）、密码子适应指数（Codon Adaptation Index, CAI）和密码子偏好指数（Codon Bias Index, CBI）的计算。所有分析均通过单条命令完成，无需编程知识，图表和数据文件自动生成。利用来自三种硬骨鱼（斑马鱼Danio rerio、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus和红鳍东方鲀Takifugu rubripes）的39条线粒体CDS序列进行的验证显示，其组成为AT富集型（平均GC含量为43.94% ± 3.85%）和中度密码子偏好（平均ENC为44.73 ± 5.22），表明突变压力和自然选择共同作用于密码子使用模式。FishCodonKit的源代码已在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.22008053）上公开。
研究背景与问题
密码子使用偏好（Codon Usage Bias, CUB）是指生物体在编码同一氨基酸时倾向于使用某些特定同义密码子的现象，这一现象普遍存在于原核和真核生物中，受突变压力、自然选择和遗传漂变的影响。CUB与基因表达、mRNA稳定性、蛋白质翻译效率和折叠速率密切相关，因此对基因功能、遗传工程和分子进化研究具有重要意义。由于线粒体基因组具有母系遗传、进化速率快和结构保守等特点，常被用作此类研究的理想模型系统。
硬骨鱼（Teleostei）是脊椎动物中物种最丰富的类群，在水产养殖和渔业中具有重要经济价值。近年来测序技术的快速发展使得大量鱼类线粒体基因组序列被存入公共数据库，为鱼类CUB的系统性研究提供了宝贵数据。然而，现有的CUB分析工具各有局限：CodonW虽应用广泛，但自2000年代以来未更新，仅输出纯文本而无可视化功能；BCAWT和CodonU为Python软件包，需编写脚本调用函数，对无编程背景的研究人员构成技术障碍；R包cubar功能更全面但需熟悉R语言；GenRCA提供易用的网页界面，但针对异源基因表达优化而非进化分析，支持的宿主种类有限（65种，且不含水生生物），输入序列长度也受限。截至目前，尚无专门针对水产养殖研究人员需求开发的综合性工具——这类工具应无需编程技能、可接受任意来源的CDS序列，并通过单条命令实现多指标计算与出版级图表生成。
研究内容与意义
研究人员开发了FishCodonKit（版本1.0），这是一个基于Python的工具包，专为水生生物CDS序列的CUB分析而设计。它将核苷酸组成统计、RSCU、ENC、CAI和CBI计算以及氨基酸组成分析整合于单一工具包中。用户可通过单条命令完成整个分析流程，系统自动生成六张出版级图表、一份格式化Excel数据文件和一份数值报告，无需任何编程知识。为验证该工具包的实用性和准确性，研究人员分析了分别属于三个目的三种代表性硬骨鱼——斑马鱼（Danio rerio，鲤形目）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus，鲈形目）和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes，鲀形目）——的39条线粒体蛋白编码CDS序列作为案例研究。该研究的意义在于为水产领域研究者提供了一个简便、高效且无需编程的CUB分析解决方案，填补了该领域的工具空白。
关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：从NCBI RefSeq数据库下载三种代表性硬骨鱼（斑马鱼NC_002333.2、尼罗罗非鱼NC_013663.1、红鳍东方鲀NC_004299.1）的线粒体基因组序列，共获取39条覆盖13个蛋白编码基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、COX1、COX2、COX3、ATP6、ATP8和CYTB）的CDS序列。研究人员开发了基于Python的FishCodonKit工具包，依赖biopython、pandas、matplotlib、seaborn、openpyxl、numpy和scipy七个第三方库。分析内容包括核苷酸组成统计、RSCU计算（依据Sharp和Li的方法）、ENC计算（依据Wright的方法）、CAI和CBI计算，以及氨基酸组成分析，均使用脊椎动物线粒体密码表（NCBI翻译表）。图表生成使用matplotlib和seaborn，分辨率为300 dpi。
研究结果
核苷酸组成分析：对39条CDS序列的GC含量进行分析，结果显示GC含量范围为33%至52%，平均值为43.94%，表明呈AT富集型组成，与硬骨鱼线粒体基因组的普遍特征一致。GC含量与ENC之间呈现微弱的负相关趋势，表明GC含量较高的序列往往表现出稍强的密码子使用偏好。在GC3含量对ENC的散点图中，大多数数据点落在仅由突变压力决定的预期曲线之下，表明这三种鱼类线粒体CDS序列的CUB同时受到突变压力和自然选择的影响。
相对同义密码子使用度（RSCU）分析：热图显示三种物种间密码子使用存在显著差异，而同种物种内的基因则表现出大致一致的密码子偏好。所有三种物种中，以A或C结尾的密码子使用频率较高（RSCU > 1），而以G结尾的同义密码子使用频率较低（RSCU < 1）。
氨基酸组成分析：在20种标准氨基酸中，亮氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的平均频率分别为17.2%、8.5%和7.2%，色氨酸为3.4%。堆叠组成图显示不同线粒体蛋白编码基因间的氨基酸组成存在明显差异，例如ATP8基因的组成与ND1、COX1等基因不同，这与线粒体蛋白的功能和结构差异相一致。
密码子使用指数分析：ENC值范围为34.0至61.0，平均值为44.7，多数值介于35至55之间，表明中度密码子偏好。尼罗罗非鱼的ND6基因ENC值最低（34.0），是唯一低于35阈值的序列，显示出最强的密码子使用偏好；而尼罗罗非鱼和红鳍东方鲀的ATP8基因达到上限61.0，表明几乎无偏好。CAI值范围为0.69至0.85，处于中高水平，四条序列超过参考阈值0.8（斑马鱼ATP8 0.852、红鳍东方鲀ATP8 0.842、尼罗罗非鱼ATP8 0.831、斑马鱼ND4L 0.813）。CBI值范围为0.290至0.585，表明三种物种的线粒体CDS序列均存在最优密码子偏好。
PR2偏倚图和中性图分析：PR2偏倚图中大部分数据点偏离中心位置（0.5, 0.5），平均位置为（0.594, 0.208），表明第三密码子位点存在不对称的突变或选择压力。中性图回归方程为y = 0.142x + 40.9（R2 = 0.137，r = 0.370，P = 0.0204），斜率0.142远小于1，对应约14%的相对中性度，表明自然选择对密码子使用的影响强于突变压力。
讨论与结论
讨论部分指出，FishCodonKit相比现有工具更具综合性、用户友好性和高效性。其三大优势包括：工作流程简单、学习曲线短，非编程人员可在几分钟内独立操作；输入序列数量不固定，可从几条到数百条线粒体CDS序列一次性处理；所有六张图表以300 dpi分辨率导出，满足多数期刊图像要求。在生物学见解方面，三种硬骨鱼的平均GC含量为43.94% ± 3.85%，呈明显的AT富集型特征，其中斑马鱼最低（约40.4%）、红鳍东方鲀居中（约45.3%）、尼罗罗非鱼最高（约47.0%）。平均ENC为44.726 ± 5.224，代表中度整体密码子偏好。GC3对ENC散点图显示多数数据点位于Wright预期曲线下方，表明自然选择也发挥作用。ATP8基因在三种物种中均显示出较高的CAI值，与其在能量代谢中的关键作用相符。工具包不限于鱼类，但需在其他类群中进一步验证；当前版本仅实现脊椎动物线粒体密码表，未来将增加其他密码表选择；当前版本未包含对应分析（Correspondence Analysis, COA），将在后续版本中添加。
结论部分：FishCodonKit为水生生物CDS序列的CUB分析提供了一个简单、无需编程的解决方案。原则上，该工具包适用于广泛的分类群，包括鱼类、甲壳类和软体动物，尽管在这些类群中的进一步验证以及对额外遗传密码表的支持仍有必要。
