基于非靶向代谢组学的不同年龄组藏羊肉品质特征及其代谢基础研究

《Animals》：Insight into the Meat Quality Characteristics of Tibetan Sheep at Different Age Groups Using Metabolomics

　　

藏羊不同年龄组肉品质与肌肉代谢的年龄相关变异仍未完全阐明。将18只临床健康、未去势雄性藏羊按年龄分为6月龄（M6）、18月龄（M18）和42月龄（M42）组，并评估其背最长肌（Longissimus dorsi）的pH、色泽、Warner–Bratzler剪切力（WBSF）、蒸煮损失、常规组成、氨基酸和脂肪酸。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）分析挥发性化合物，同时采用非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）评估肌肉代谢物。结果显示，M42组藏羊的蛋白质和脂肪含量最高，剪切力最大。值得注意的是，单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）水平在M18组最高，形成独特的风味谱，提示脂肪酸组成的年龄相关差异，而非明确的代谢转折点。代谢组学分析鉴定出差异代谢物，主要富集于氨基酸和脂质代谢通路。相关分析显示，包括富马酸（fumaric acid）和亚油酸（linoleic acid）在内的关键代谢物与肉品质参数显著相关。该研究阐明了不同年龄组藏羊的肉品质特征及代谢基础，为改善肉品质提供了理论基础。

研究背景：藏羊（Tibetan sheep）是青藏高原原生绵羊资源，长期适应低温、低氧高原环境，具有较强环境适应性和特色生产性状；为牧区提供优质羊肉，并支撑当地畜牧业可持续发展。藏羊肉以高蛋白、相对低脂肪和特征风味受到高端市场重视。肉品质形成受遗传背景、生产环境和发育阶段等多因素影响，其中生长阶段可通过改变肌肉生理、代谢活性和组织架构，影响嫩度、色泽、持水力和风味。已有研究表明，畜禽肉中氨基酸、脂肪酸和挥发性化合物含量随年龄变化；在藏羊中，Wang et al. 利用蛋白质组和磷酸化蛋白质组方法显示糖酵解及AMPK、HIF-1信号通路与肌肉嫩度发育调控密切相关，Ma et al. 报道年龄组间肉品质变异与瘤胃微生物及相关基因表达变化有关。然而，传统肉品质评估和脂肪酸分析虽可描述年龄相关表型和组成差异，却不能全面表征伴随的小分子代谢变异；针对藏羊生长阶段依赖的肉品质差异的代谢组学研究仍较少。代谢组学可提供小分子代谢物综合信息，较直接反映生理状态和代谢扰动。因此，研究人员以6、18、42月龄藏羊为对象，假设不同年龄组背最长肌（Longissimus dorsi，LD）肉品质性状、脂肪酸组成和挥发性谱存在差异，并伴随氨基酸、脂质和能量代谢相关小分子代谢物变化；旨在表征年龄组间组成和代谢差异，鉴定与嫩度、脂质组成和挥发性谱相关的候选代谢物-品质关联，为评估屠宰阶段和自然放牧条件下藏羊肉品质提供化学和代谢基础。

研究人员在同一实验框架内评估理化性状、常规组成、氨基酸和脂肪酸谱、挥发性化合物及非靶向肌肉代谢组。结论显示，M42组蛋白质和脂肪含量最高、剪切力最大；M18组MUFA和PUFA最丰富，并形成独特挥发性谱；差异代谢物主要富集于氨基酸和脂质代谢通路；富马酸和亚油酸与肉品质参数显著相关。该研究阐明了不同年龄组藏羊肉品质特征和代谢基础，为改善肉品质提供了理论基础。

主要关键技术方法：样本来自中国青海省海盐县约3500 m高寒草场同一自由放牧羊群，18只临床健康未去势雄性藏羊，6、18、42月龄各6只，同一放牧和屠宰期管理，无精料补饲。测定LD的pH₂₄、色泽、WBSF、蒸煮损失、水分、粗蛋白和粗脂肪；采用氨基酸分析仪测定氨基酸，气相色谱测定脂肪酸，HS-SPME/GC-MS分析挥发性有机化合物（VOCs），非靶向LC-MS分析肌肉代谢物；结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、变量投影重要性（VIP）≥1与t检验筛选差异代谢物，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集和Mantel相关分析。

研究结果：
3.1 不同年龄组肉品质性状：通过肉品质指标测定发现，剪切力随年龄增加，M42最高（49.76 N，p<0.05）；pH呈上升趋势，但M18与M42差异不显著；M6的L*、a*和蒸煮损失最高；M6水分高于M42，蛋白质和脂肪低于M42，M6与M18差异不显著。
3.2 不同年龄组氨基酸组成：氨基酸分析显示，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸不受年龄显著影响；苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸在M42高于M6；丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和总氨基酸随年龄增加，半胱氨酸下降；必需和非必需氨基酸总量在M42最高，显著高于M6和M18，M6与M18无显著差异。
3.3 不同年龄组脂肪酸谱：共鉴定19种脂肪酸，包括9种饱和脂肪酸（SFA）和10种不饱和脂肪酸。C6:0、C16:0、C17:1n7、C18:2n6c和C20:5n3在M42低于M6和M18；C14:0、C17:0、C24:0和总SFA随年龄升高；C14:1n5和C16:1n7随年龄下降；C18:0升高，但M6与M18差异不显著；C18:1n9c、C22:6n3、C18:3n3、总MUFA和总PUFA从M6至M18升高后下降，M18最高；C10:0、C12:0、C15:0、C18:1n9t和C20:4n6无显著年龄效应。
3.4 不同年龄组VOCs：GC-MS鉴定32种VOCs，包括10种醛、5种醇、2种酮、5种酯、6种含硫化合物、1种羧酸、2种烃和1种呋喃；偏最小二乘判别分析显示三组分离；13种VOCs随年龄增加，包括(E)-2-戊烯醛、庚醛、己醛、壬醛、2-甲基丁醛、2-十一烯醛、2-甲基噻吩、2-甲基丙酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯、2-己酮、3-己烯-2-酮、3-甲基丁醛和苯甲醛；2-丁氧基乙醇和乙酸逐渐下降；辛醛和乙酸乙酯有增加趋势，但部分组间差异不显著；1-辛醇随年龄下降，M18与M42相近。
3.5 代谢物组成与多变量统计分析：质控样本紧密聚类，平台重复性良好；共检测1375种代谢物，分25类，氨基酸及衍生物最多（332种，24.12%），其次为有机酸及衍生物（143种，10.41%）、苯衍生物（89种，6.49%）和甘油磷脂（89种，6.48%）；两两OPLS-DA显示组间明显分离，模型R2>0.9，置换检验Q2截距分别为?0.04、0.04和?0.06，解释力较高且无明显过拟合；M18组内聚类最紧凑，与其他组分离最清晰。
3.6 差异代谢物分析：三组两两比较共检测681种差异代谢物；Venn图显示与M6、M18、M42相关的重叠代谢物分别为98、34和53种；火山图显示M6 vs M18上调137种、下调108种，M6 vs M42上调128种、下调139种，M18 vs M42上调78种、下调91种；三种比较中脂肪酸酰基、氨基酸及相关代谢物为主要差异类别。
3.7 核心差异代谢物KEGG富集分析：以p<0.05且VIP>1.5筛选保留114种核心差异代谢物；KEGG富集主要涉及精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，全局代谢通路，脂肪细胞脂解调控和cAMP信号通路；精氨酸生物合成及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢与氮稳态和碳氮分配相关，可能影响肌肽形成；cAMP信号通路参与脂肪细胞脂解调控；亚油酸代谢因可能贡献脂质稳态而受到关注。
3.8 肉品质与主要差异代谢物相关分析：采用10个最显著差异代谢物进行Mantel热图分析；富马酸、琥珀酸、鹅肌肽、L-缬氨酸、葡萄糖、亚油酸和α-酮戊二酸与脂肪含量、蒸煮损失、WBSF、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、C20:5n3和C22:6n3等品质和营养指标显著相关；富马酸、琥珀酸、鹅肌肽、腺苷、L-缬氨酸、丙酮酸、亚油酸和α-酮戊二酸与1-辛醇、2-甲基丁醛、辛醛和庚醛等代表性VOCs显著关联；脂肪含量、WBSF、赖氨酸、C20:5n3和C22:6n3与富马酸、琥珀酸、腺苷、L-缬氨酸和亚油酸呈强相关（p<0.01）。

讨论部分总结：讨论指出，剪切力从M6至M42升高指示嫩度随年龄下降，可能解释包括肌内胶原密度和交联增加；年轻动物水分较高、脂肪较低，与其肌肉和脂肪组织仍处于发育阶段一致；M6的L*和a*较高提示年龄影响色泽，讨论将其与肌红蛋白浓度、氧化还原状态以及高原低氧下HIF-1α信号、氧化应激和谷胱甘肽氧化还原稳态相联系。蛋白质和脂肪增加、水分下降反映正常肌肉成熟。M42中苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和总氨基酸较高，提示蛋白质沉积增强和成熟肌肉氨基酸需求改变；支链氨基酸除作为蛋白质合成底物外，还可作为代谢信号激活mTOR通路并调控蛋白质周转；天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸相对稳定，提示这些化合物可能受较严格稳态控制；半胱氨酸下降作为谷胱甘肽前体，可能反映较高氧化需求。脂肪酸年龄重塑表现为C6:0、C16:0、C17:1n7、C18:2n6c和C20:5n3在M42较低，而C14:0、C17:0、C18:0、C24:0和总SFA随年龄升高；C18:1n9c、C22:6n3、C18:3n3、总MUFA和总PUFA在M18达峰，提示该阶段对脂质沉积和风味发育有利；C18:2n6c为人体必需脂肪酸，其氧化和酯化产物可形成挥发性醛类；C14:1n5和C16:1n7下降及C18:0升高可能反映去饱和能力变化。挥发性差异以醛、醇、酮、酯和含硫化合物为主；己醛、庚醛和壬醛为亚油酸和花生四烯酸氧化产物，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛来自支链氨基酸Strecker降解；1-辛醇随年龄下降，并与蘑菇样、青草样和蔬菜样气味相关。代谢组显示氨基酸衍生物和有机酸衍生物占LD代谢组最大比例；OPLS-DA分离说明生长阶段重塑肌肉代谢状态，M18聚类最紧且区分清楚，但横断面设计不能确定18月龄为代谢转折点；相关分析提示潜在生物学关联，但不证明直接因果关系。KEGG富集通路与氮平衡、碳氮通量分布、脂质动员和能量调节相关，为品质差异提供生化框架；肌肽与肌肉抗氧化能力和pH缓冲有关。富马酸和琥珀酸为三羧酸（TCA）循环中间物，与多个肉品质性状相关，可能反映肌肉能量代谢差异，但线粒体功能、氧化应激和胶原交联未直接测定，机制仍待明确；L-缬氨酸与剪切力相关，可能反映其调节肌肉蛋白质代谢；亚油酸与脂肪含量和PUFA丰度相关，符合其膜磷脂成分和长链PUFA前体功能；鹅肌肽与1-辛醇负相关，鹅肌肽具抗氧化和金属螯合特性，较高鹅肌肽样本中1-辛醇较低可能反映脂质氧化降低。研究局限包括样本量较小和横断面设计；体重和生理成熟度可能影响肉品质和肌肉代谢物谱，不能完全与年龄相关差异区分。

研究结论（翻译）：该研究系统比较了藏羊生长阶段相关肉品质和肌肉代谢物组成差异。M42组肉蛋白质和脂肪含量最高且剪切力最大，而MUFA和PUFA在M18组最丰富，使该年龄阶段具有独特挥发性谱。差异代谢物主要富集于氨基酸和脂质相关通路。其中，富马酸和亚油酸与肉品质性状强相关。这些发现为选择适宜屠宰年龄和改善藏羊肉品质提供了生化依据。