虹鳟（Oncorhynchus mykiss）幼鱼脊柱畸形与联体双胎畸形的转录组分析：候选基因与潜在信号通路

《Healthcare》：Transcriptomic Analysis Reveals Candidate Genes and Potential Pathways Associated with Spinal Deformity and Conjoined Twin Malformation in Oncorhynchus mykiss Larvae

　　

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是一种全球养殖的冷水性鲑科鱼类，但三倍体幼鱼常出现脊柱腹侧前凸和联体双胎畸形，其分子机制尚不清楚。研究人员对15 dph的正常（N）、脊柱畸形（SD）和联体双胎（CT）三倍体幼鱼进行RNA-seq，获得54.13 Gb有效数据，分别在SD vs. N、CT vs. SD和CT vs. N比较组中鉴定出4292、3601和2699个差异表达基因（DEG）。鉴定到5条共有的紊乱级联通路（细胞黏附、神经活性配体-受体相互作用、吞噬体、细胞因子-受体相互作用和PI3K-Akt信号），而潜在的钙/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与类固醇生物合成相关通路分别在SD和CT幼鱼中主要受到扰动。过滤后的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）亚网络显示出不同的预测拓扑表型相关候选转录本，其中凝血和补体转录本在SD幼鱼中形成核心枢纽，类固醇相关转录本在CT组中显示弱连接。筛选出3个表达模式相反的判别性转录本。该研究揭示了两种畸形保守及表型特异的转录组相关特征，并为后续幼鱼畸形的功能验证提供了候选转录本。需要指出的是，所有转录组数据均来自全幼鱼匀浆；联体双胎幼鱼的表达特征可能受组织类型比例改变的影响，而非仅由畸形特有调控机制造成。

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是全球养殖的重要冷水性鲑科鱼类，在经济上具有重要价值。三倍体幼鱼在孵化过程中常出现脊柱腹侧前凸和联体双胎畸形，导致苗种大量损失。传统孵化后表型检查难以早期识别胚胎缺陷，此前也没有对这两种畸形进行平行转录组比较的研究。为此，研究人员对正常（N）、脊柱畸形（SD）和联体双胎（CT）三倍体幼鱼开展转录组测序（RNA-seq），旨在解析两种常见幼鱼畸形的共享与特异分子通路，为降低孵化场畸形率提供理论基础。

**主要技术与方法**
样品来自中国水产科学研究院东海水产研究所江苏赣榆研究中心；同一家系6尾XX雌鱼与4尾性逆转XX雄鱼混合授精所得约4200枚受精卵经60 MPa高压静水压（HHP）处理诱导全雌三倍体，统一循环水孵化。15 dph按外部形态分为N、SD和CT三组，每组3个单幼鱼生物学重复，联体双胎幼鱼视为一个独立重复，每尾经流式细胞术确认三倍体。主要方法：Illumina NovaSeq X Plus平台150 bp双端测序；fastp质控；HISAT2比对至参考基因组GCF_013265735.2；StringTie组装、RSEM定量；DESeq2筛选差异表达基因（DEG）（|log₂FC|≥1，padj<0.05）；利用GOATOOLS和KOBAS进行基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，Cytoscape进行拓扑分析与核心基因筛选。

**研究结果**

**3.1 幼鱼外部形态表型观察**
体视显微镜下，N组幼鱼躯干细长、双侧对称、脊柱完整；SD组幼鱼中躯干出现明显腹侧前凸，破坏双侧对称性；CT组幼鱼腹侧融合、共享单个卵黄囊，具有两个头、胸鳍和尾鳍，融合躯干段可见同步脊柱弯曲。同时具有明显联体融合和严重脊柱前凸的混合表型个体被排除，以保证分组清晰。

**3.2 转录组测序数据质控**
9个幼鱼样本共获得54.13 Gb有效数据，每个文库Q30值均大于95.3%，clean reads比对率为94.11%–94.69%，表明测序数据质量良好。

**3.3 样本相关性与主成分分析**
基于rlog转换的计数矩阵计算显示，各组内生物学重复的相关系数均高于0.88。主成分分析（PCA）显示N、SD和CT三组明显分离，无重叠聚类，PC1解释37.36%的转录方差，PC2解释27.79%，证明三种表型之间存在明确的转录组差异。

**3.4 差异表达基因鉴定**
SD vs. N共鉴定到4292个DEG，其中上调1643个、下调2649个；CT vs. N鉴定到2699个DEG，其中上调1365个、下调1334个；CT vs. SD鉴定到3601个DEG，其中上调1816个、下调1785个。UpSet图展示了各比较组共有和特有的DEG分布。

**3.5 GO富集分析**
SD vs. N的DEG显著富集于胞外空间、突触膜、化学突触传递调节、跨突触信号调控等GO条目；CT vs. N显著富集于胞外空间、内肽酶活性、作用于配对供体的氧化还原酶活性等条目；CT vs. SD显著富集于胞外空间、丝氨酸型内肽酶活性、免疫效应过程和细胞杀伤等条目。

**3.6 KEGG通路富集分析**
SD vs. N的DEG显著富集于细胞黏附分子、神经活性配体-受体相互作用、吞噬体、MAPK信号通路和钙信号通路；CT vs. N的DEG显著富集于亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、类固醇激素生物合成、吞噬体和马达蛋白；CT vs. SD的DEG显著富集于神经活性配体-受体相互作用、心肌收缩、吞噬体、内质网蛋白加工和细胞色素P450外源物代谢。按padj<0.05进行跨比较汇总后，共鉴定出5条共享紊乱级联通路：细胞黏附、神经活性配体-受体相互作用、吞噬体、细胞因子-受体相互作用和PI3K-Akt信号；钙/MAPK相关通路主要与SD表型相关，类固醇生物合成相关通路主要与CT表型相关。

**3.7 PPI网络分析**
SD vs. N网络含257个节点和300条边，serpinc1、f2、fga、c5、c8a、c9等凝血和补体转录本形成紧密的核心功能模块；CT vs. N网络含268个节点和300条边，核心为两个高连接度未注释转录本LOC100135840和LOC110523600，周围分布类固醇代谢、蛋白折叠和氨基酸代谢相关转录本；CT vs. SD网络含207个节点和300条边，核糖体蛋白转录本rps12、rpl9形成致密核心模块，同时存在线粒体核糖体基因和补体基因形成的次级交互簇。

**3.8 与畸形相关的特征DEG表达模式**
共筛选出13个表型相关候选转录本，包括col9a、cd8a、grm5、cnr1、cacng8b、cyp21a、cyp3a、cyp2u1、c3-3、ncf1、anpep、slitrk3和itpr1。SD vs. N中，细胞黏附基因col9a呈上调趋势，cd8a呈下调趋势，神经活性配体-受体相互作用通路中的grm5和cnr1受抑制；CT vs. N中，类固醇合成基因cyp21a高度诱导而cyp3a显著抑制，cyp2u1明显升高，吞噬体相关免疫因子c3-3和anpep下调而ncf1上调；CT vs. SD中，grm5在CT中维持较高表达，c3-3和anpep在CT中降低，slitrk3和itpr1上调。最终筛选出slitrk3、itpr1和grm5三个在两种畸形之间呈相反表达模式的判别性转录本。

**讨论总结**
三倍体幼鱼存在广泛的转录组重塑，共享紊乱主要涉及神经免疫和细胞黏附相关通路；钙/MAPK信号与类固醇生物合成信号分别对应SD和CT表型。PPI亚网络中，免疫-凝血模块在SD相关比较中形成核心枢纽，类固醇代谢相关转录本在CT相关网络中出现，核糖体蛋白模块则在CT vs. SD网络中占主导。但所有转录组数据均来自全幼鱼匀浆，CT联体双胎幼鱼的表达信号可能受器官-组织比例改变混杂，且每组仅3个生物学重复，统计检验力有限。因此，这些结果为初步转录组关联证据，尚不能确立因果，仍需组织靶向测序、CRISPR基因编辑和多时间点qRT-PCR进一步验证。

**研究结论（译文）**
本研究首次对正常、脊柱畸形和联体双胎三倍体O. mykiss幼鱼进行转录组与PPI拓扑联合分析，鉴定出两种畸形共有的神经免疫和细胞黏附级联紊乱，同时发现SD幼鱼中钙/MAPK相关成骨转录改变和CT幼鱼中类固醇生物合成信号的特征性变化。三个过滤后的PPI亚网络表现出不同拓扑特征，整合筛选得到slitrk3、itpr1和grm5三个在幼鱼表型间呈相反表达模式的判别性候选转录本。这些结果为了解两种典型幼鱼畸形的不同分子病理关联提供了依据，并为鱼类胚胎发育研究提供转录组参考。需要指出，所有转录组数据来自全幼鱼匀浆，联体双胎幼鱼的表达信号可能受器官-组织比例改变混杂；仍需组织靶向测序和CRISPR功能实验验证候选枢纽基因及信号级联。