红葱水提物对豹纹鳃棘鲈肠道健康的调节效应：基于生长、形态、微生物群及代谢组学的综合研究

《Animals》：Modulatory Effects of Water Extract from Eleutherine americana on Intestinal Health: Insights from Growth, Morphology, Microbiota and Metabolomics in Plectropomus leopardus

　　

本研究评估了饲料中添加红葱（Eleutherine americana）水提物（EAW，添加量分别为0 [NC]、1 [LD]、5 [MD]和10 [HD] mL/kg）对480尾豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus；初始体重为11.72 ± 0.34 g）幼鱼的影响，试验周期为8周，每个处理组设4个重复缸，每缸30尾鱼。EAW未显著改善生长性能，但MD和HD组的存活率显著高于NC组（p < 0.05）。组织学观察显示，EAW组鱼肠道黏膜皱襞更完整、隐窝深度更大、杯状细胞数量更多。代谢组学分析显示，EAW组肉碱（carnitine）水平降低，而磷脂和前列腺素代谢物水平升高，并在胆汁酸生物合成、氨基酸代谢和碳代谢通路中检测到显著差异。肠道微生物群分析显示，EAW组中变形菌门（Pseudomonadota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度降低，LD和MD组中放线菌门（Actinomycetota）降低，MD组中拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Bacillota）升高。在属水平上，EAW组中Bradyrhizobium、Microbacterium和Sphingobium的丰度降低，而Afipia的丰度升高。功能谱分析显示碳水化合物、氨基酸和脂质代谢类别存在差异。微生物群-代谢物相关性网络分析鉴定出变形菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、己糖神经酰胺（hexosylceramides）和肉碱（carnitines）为高度关联的特征。网络药理学分析鉴定出pdgfra、pdgfrb和sirt1为EAW主要成分红葱酚（eleutherol）、红葱素（eleutherin）和异红葱素（isoeleutherin）的候选靶点。存活率和肠道相关研究结果支持进一步评估EAW作为豹纹鳃棘鲈肠道健康饲料添加剂的可行性。

一、研究背景与目的

豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）隶属鲈形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae），广泛分布于印度-太平洋热带和亚热带海域，是重要的经济养殖鱼类。其生长、生理应激反应和体色等性状已围绕环境条件、操作管理和饲料添加等方面开展了大量研究，基因组资源也已开发用于辅助选择育种。然而，细菌感染和肠炎仍是养殖过程中的重要健康威胁，亟需开发支持肠道健康的饲料策略。

中草药饲料添加剂已被研究作为传统疾病管理策略的替代或补充方案。红葱（Eleutherine americana）为鸢尾科（Iridaceae）植物，其异红葱素（isoeleutherin）可抑制巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和NF-κB信号通路，粗提物在熟猪肉模型中表现出抗氧化和抗菌活性。此外，红葱制剂可影响人肠道微生物培养中的细菌生长，并增加婴儿来源微生物培养物中的短链脂肪酸产量。在养殖动物中，红葱属制剂的研究显示：在条纹鲶鱼（Pangasianodon hypophthalmus）中，红葱球茎提取物在30–60 g/kg饲料添加水平下显著提高终末体重和平均周增重，并在45 g/kg水平下提高淀粉酶活性；在南美白对虾（Litopenaeus vannamei）中，红葱粉末可提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性、肠道周长比和微绒毛密度，并增强免疫指标和改善攻毒后存活率；在蛋鸡中，饲料添加10 g/kg红葱粉末可显著降低粪便pH和肠杆菌科数量，同时增加乳酸菌数量。

豹纹鳃棘鲈的肠炎与肠道微生物群改变及炎症和代谢反应相关，维持肠道健康是养殖中的重要目标。然而，红葱对豹纹鳃棘鲈肠道健康的影响此前尚未被研究。本研究旨在探讨饲料中添加红葱水提物对豹纹鳃棘鲈肠道代谢物和微生物群的影响，并利用网络药理学探究候选作用机制。

二、主要技术方法

研究人员制备了红葱水提物（EAW）：新鲜红葱茎经清洗、50 °C鼓风干燥2天后粉碎，500 g干粉与1000 mL蒸馏水室温磁力搅拌提取24小时，真空过滤后获得900 mL滤液，每毫升约相当于0.556 g起始干茎材料。EAW经液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）分析其主要成分。

实验用豹纹鳃棘鲈幼鱼购自海南陵水德林诚信水产养殖有限公司，在中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心室内实验缸中驯化14天。驯化期间水温28 ± 1 °C、pH 7.8 ± 0.3、盐度25–28 ppt、溶解氧≥7.0 mg/L。驯化结束后，初始平均体重11.72 ± 0.34 g的鱼随机分为4个处理组：NC（对照，0 mL/kg EAW）、LD（1 mL/kg）、MD（5 mL/kg）和HD（10 mL/kg），每组4个重复圆缸（500 L），每缸30尾，共480尾。EAW在投喂前均匀喷洒于商品饲料表面。试验为期8周，每日07:30和17:30投喂至表观饱食。试验结束后计算存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和肥满度（CF）。每个重复缸随机取4尾存活鱼用于组织学、代谢组学和宏基因组学分析，取样部位为后肠。

主要技术方法包括：组织病理学分析（苏木精-伊红染色，测量黏膜皱襞长度和宽度、肌层厚度、黏膜厚度、隐窝深度和杯状细胞数量）；代谢组学分析（超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用，数据经Compound Discoverer 3.1处理，代谢物注释参考mzCloud、mzVault、MassList、KEGG、HMDB和LIPIDMaps数据库，差异代谢物鉴定采用p < 0.05且|log₂(Fold Change)| > 1的标准）；宏基因组学分析（CTAB-SDS法提取DNA，Illumina NovaSeq平台双端250 bp测序，Kraken2分类、Bracken估算丰度、HUMAnN 3进行功能注释）；微生物群-代谢物相关性网络分析（MetaNet R包，Spearman |r| > 0.6且p < 0.05）；网络药理学和分子对接（从PubChem获取5种成分的SMILES结构，经SwissTargetPrediction和TargetNet预测靶点，肠炎相关靶点从GeneCards、OMIM和TTD获取，STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，AlphaFold Server获取蛋白质三维结构，AutoDock进行分子对接）。

三、研究结果

3.1 EAW的主要成分

色谱和质谱分析注释了EAW中的酚类和有机酸衍生物，包括柠檬酸（C₆H₈O₇）、苯甲酸（C₇H₆O₂）、多种红葱酚异构体（C₁₄H₁₂O₄）以及结构相关的衍生物如异红葱素和红葱素（C₁₆H₁₆O₄）。

3.2 EAW对豹纹鳃棘鲈生长性能的影响

LD和MD组的终末体重、增重率和特定生长率略高于NC组，但差异不显著（p > 0.05）。MD和HD组的存活率显著高于NC组（p < 0.05）。各组间肥满度无显著差异。

3.3 EAW对豹纹鳃棘鲈的组织病理学改变

NC组肠道切片显示上皮破裂，而EAW组（尤其是MD组）黏膜皱襞更完整，杯状细胞分布更规则。黏膜皱襞长度在各组间无显著差异。在缸均值比较中，LD和MD组的隐窝深度大于NC组，HD组的杯状细胞数量高于NC组（p < 0.05）。

3.4 EAW引起的代谢组学改变

共检测并鉴定出1363种代谢物，脂质、核酸和肽类为肠道代谢组的主要成分。主成分分析（PCA）未显示各组间明显分离，而有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示EAW组与NC组之间存在分离。差异代谢物分析鉴定出LD组18个（8个上调、10个下调）、MD组88个（29个上调、59个下调）、HD组105个（69个上调、36个下调）。EAW组中多种酰基肉碱降低，而多种溶血磷脂和前列腺素相关代谢物升高。随机森林分析对前15个重要代谢物进行了排序。KEGG富集分析显示：LD组富集初级胆汁酸生物合成及牛磺酸和次牛磺酸代谢通路；MD组富集丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及类固醇激素生物合成通路；HD组富集碳代谢及乙醛酸和二羧酸代谢通路。

3.5 EAW引起的肠道微生物群改变

主坐标分析（PCoA）显示了微生物群落组成的变异。物种丰富度及Shannon、Simpson和Chao1指数在各处理组间无显著差异。优势菌门为变形菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Bacillota）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。EAW组中变形菌门和担子菌门的相对丰度低于NC组；LD和MD组（而非HD组）中放线菌门降低；MD组中拟杆菌门和厚壁菌门升高。在属水平上，EAW组中Bradyrhizobium、Microbacterium和Sphingobium的相对丰度降低，而Afipia升高。KEGG功能分析显示，LD和HD组中碳水化合物代谢相关基因丰度显著高于NC组，MD和HD组中氨基酸代谢基因丰度较高，HD组中脂质代谢和其他氨基酸代谢基因丰度较高。微生物共现网络显示LD、MD和HD组的节点和边数均多于NC组。

3.6 肠道微生物群与代谢物的相互作用

Spearman相关性网络将肠道微生物类群（包括变形菌门和放线菌门）与脂质代谢物联系起来。己糖神经酰胺和肉碱与多个类群相关，在网络中具有高度连接性。

3.7 EAW促进肠道健康的多重调控基因

从GeneCards、OMIM和TTD共获得2594个肠炎相关靶点。EAW预测靶点354个，其中154个与肠炎相关靶点重叠。GO富集分析包括对有机物质的细胞反应、对脂质的细胞反应和蛋白质代谢过程。KEGG富集分析包括钙信号通路、细胞衰老和细胞凋亡。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络包含154个EAW-肠炎靶点，其中Pdgfrb、Pdgfra、Sirt1、LOC121956703和LOC121945745具有最高节点度。选择Pdgfra、Pdgfrb和Sirt1与EAW主要成分红葱酚、红葱素、异红葱素、柠檬酸和苯甲酸进行分子对接，15个成功的成分-靶点组合均具有负结合能，最低能量构象将红葱酚、红葱素和异红葱素置于蛋白质活性口袋中，疏水相互作用为主要结合模式。

四、讨论与结论

讨论部分指出，EAW在豹纹鳃棘鲈幼鱼中产生了生长和存活方面的不同响应。生长指标未显著改善，但MD和HD组存活率显著提高。组织学发现提示肠道保护可能有助于存活率差异，更完整的黏膜皱襞和增加的杯状细胞数量与黏膜屏障反应一致。肠道酰基肉碱降低提示EAW补充后脂肪酸处理发生改变，酰基肉碱积累与哺乳动物肌肉中不完全脂肪酸氧化相关，肠道炎症可损害上皮对这些底物的利用，而乙酰-L-肉碱可改善小鼠结肠炎的屏障功能。溶血磷脂和前列腺素相关代谢物的变化可能参与黏膜反应，前列腺素E2（PGE2）在小鼠修复模型中促进上皮再生。通路模式随EAW添加水平变化，涉及LD组的胆汁酸和牛磺酸代谢、MD组的氨基酸代谢以及HD组的中心碳代谢。微生物群落组成发生变化但α多样性无显著增加，变形菌门和担子菌门在补充组中减少，MD组中拟杆菌门和厚壁菌门增加。不同红葱属饲喂研究间的响应差异提示可能取决于宿主物种、生命阶段、制剂和剂量。碳水化合物和氨基酸相关基因谱提示微生物营养利用潜力的变化。网络药理学鉴定出pdgfra、pdgfrb和sirt1为候选宿主靶点，PDGF-BB可促进人结肠成纤维细胞增殖和伤口闭合，SIRT1激活可减少实验性结肠炎中内质网应激相关的上皮凋亡，肠道上皮SIRT1缺失可扰乱小鼠微生物群依赖性稳态。由于肠道样本仅从终点存活者采集，代谢和微生物谱可能同时反映对EAW的响应和存活者组成的差异，其与存活响应的时间关系无法确定。未来研究中的病原攻毒和直接免疫功能测量将有助于阐明肠道保护机制。

研究结论为：EAW补充与更高的存活率以及终点存活者中肠道形态、代谢物和微生物群的改变相关。网络药理学鉴定出pdgfra、pdgfrb和sirt1为EAW成分可能通过其发挥肠道保护作用的候选靶点。生长指标无显著差异，但存活率和肠道相关发现支持进一步评估EAW作为豹纹鳃棘鲈功能性饲料添加剂的可行性。