《Animals》：Comparative Evaluation of Conventional and Real-Time PCR Assays for the Epidemiological Surveillance and Molecular Characterization of Leptospira in Asymptomatic Stray Dogs
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钩端螺旋体病是一种广泛传播的影响动物和人类的细菌性疾病。犬只可在不表现任何症状的情况下携带这些细菌，对人类和其他动物构成潜在健康风险。本研究通过采用血清学方法分析血液样本以及四种分子方法分析尿液样本，调查了波斯尼亚和黑塞哥维那地区外表健康的流浪犬中钩端螺旋体的
钩端螺旋体病是一种广泛传播的影响动物和人类的细菌性疾病。犬只可在不表现任何症状的情况下携带这些细菌，对人类和其他动物构成潜在健康风险。本研究通过采用血清学方法分析血液样本以及四种分子方法分析尿液样本，调查了波斯尼亚和黑塞哥维那地区外表健康的流浪犬中钩端螺旋体的暴露情况及其尿液中的DNA存在。在初步队列中，124只犬中有53只（42.74%）显示出钩端螺旋体暴露的血清学证据，分子发现提示其尿液中存在钩端螺旋体DNA，尽管部分分子发现未得到测序确认。通过结合血清学和分子技术，获得的阳性发现数量高于单独使用任何一种方法。这些发现突显了在外表健康的流浪犬中存在钩端螺旋体暴露和DNA检出，并强调了整合不同诊断方法对有效监测和控制的价值。
论文解读：无症状流浪犬钩端螺旋体病的多方法比较研究
研究背景与研究目的
钩端螺旋体病是一种全球性人兽共患病，由致病性钩端螺旋体属细菌引起，被公认为具有显著再流行潜力的重大公共卫生问题。虽然该病分布全球，但在热带和亚热带地区尤为普遍。随着气候变化导致的极端天气事件增多以及城市扩张加剧人类、家养动物和野生动物之间的接触，温带地区的发病率预计将上升。犬只在钩端螺旋体感染的流行病学中扮演重要角色，既可成为偶然宿主也可成为维持宿主。它们可以在有或无临床症状的情况下通过尿液排出细菌，从而污染环境并对公共健康构成实质性风险。由于犬只比人类更易接触环境感染源，它们可作为环境污染的哨兵或连接环境与人群的潜在流行病学桥梁。
目前存在的主要问题包括：显微镜凝集试验作为参考血清学方法存在诸多局限，如严格依赖活抗原面板、无法可靠区分活动性感染与既往暴露或疫苗接种、存在交叉反应性等。此外，抗体通常在感染后一到两周内无法检出，阻碍早期诊断。MAT对于识别慢性无症状肾脏携带和钩端螺旋体尿症也不理想，因为血清抗体滴度不一定与排菌相关。另一方面，细菌分离培养特异性高但耗时长、诊断灵敏度低且易受污染。因此，亟需补充使用分子方法进行检测。
本研究的目的是：（一）评估和比较不同PCR检测方法在尿液样本上的性能并确定其一致性；（二）利用显微镜凝集试验筛查抗钩端螺旋体抗体；（三）分析该无症状流浪犬群体中血清学与分子发现的一致性。此外，通过对选定的rrs和secY阳性扩增子进行测序和系统发育分析，鉴定循环于这些动物中的特定钩端螺旋体种类。
研究方法
研究人员从波斯尼亚和黑塞哥维那西北部三个相邻市镇收集了124只无症状流浪犬的配对血样和尿样，另纳入11只先前研究中商业qPCR阳性的犬只作为阳性富集面板。关键技术方法包括：（一）显微镜凝集试验用于血清学检测，采用十个代表八个血清群的参考血清型；（二）商业定量PCR检测，靶基因未公开；（三）基于lipL32基因的TaqMan探针法qPCR检测；（四）针对rrs基因的传统PCR检测；（五）采用G1/G2和B64-I/B64-II引物组的多重PCR检测；（六）对选定阳性扩增子进行Sanger测序和系统发育分析，分别采用邻接法和最大似然法构建rrs和secY基因的系统发育树。
研究结果
3.1 通过PCR检测的分子检测结果
在124只犬的主要分析队列中，商业qPCR检测出31份尿液样本阳性（25.00%）。lipL32 qPCR获得25份阳性结果（20.16%），所有阳性样本均同时被商业qPCR检出。传统rrs PCR检出34份阳性样本（27.42%），而mPCR检出23份阳性结果（18.55%），所有阳性结果均来自G1/G2引物组，B64-I/B64-II引物组未产生任何阳性扩增。在31份商业qPCR阳性样本中，27份（87.10%）同时被rrs PCR检出阳性，21份（67.74%）被mPCR检出阳性，25份（80.65%）被lipL32 qPCR检出阳性。值得注意的是，在93份商业qPCR阴性样本中，有7份通过传统rrs PCR检出阳性，2份通过mPCR检出阳性，但这些发现缺乏可靠的序列确认。分子检测方法间表现出高度一致性，Kappa值范围为0.72至0.86。
3.2 系统发育分析结果
对24份样本进行rrs和secY基因测序，所有回收序列均属于致病性钩端螺旋体分支。rrs序列与L. interrogans复合群高度相似，但由于该短片段序列多样性有限，无法对所有样本进行明确的种水平鉴定。secY基因提供了更高的分类分辨率，12份成功分析的序列中，11份与L. interrogans具有99-100%同源性，1份与L. borgpetersenii具有99%同源性。这是首次在波斯尼亚和黑塞哥维那进行的钩端螺旋体分子特征描述。
3.3 显微镜凝集试验血清学结果
MAT确定的血清学暴露率为20.97%（26/124）。最常观察到的终点滴度为1:100（34.62%），最高滴度为1:1600。血清学反应以Australis血清群为主，50.00%的血清阳性犬检测到针对Australis血清型的抗体。其他反应血清型包括Pomona（42.31%）、Icterohaemorrhagiae（26.92%）、Canicola（15.38%）、Grippotyphosa（11.54%）和Sejroe（3.85%）。未观察到针对Bataviae、Autumnalis或Hardjo血清型的反应。在31只商业qPCR阳性犬中，13只（41.94%）为MAT阳性，18只（58.06%）为MAT阴性。qPCR与MAT之间的总体一致性为75.00%，Cohen's κ = 0.30，表明一致性一般。
综合所有诊断方法的结果，124只犬中有53只（42.74%）至少有一项阳性发现，其中包括9只在MAT和商业qPCR均为阴性的犬仅通过传统PCR检出阳性，但这些发现缺乏可靠的序列确认。
讨论与结论
本研究表明，使用具有已知和未知遗传靶标的分子检测方法进行比较分析，可为调查尿液中的钩端螺旋体DNA提供互补性发现，并有助于识别不一致和潜在的非特异性扩增结果。将血清学暴露评估与分子技术相结合，能够比单独使用任何一种方法更全面地评估所检群体的血清学和分子发现。然而，未经确认的分子扩增应谨慎解读并单独归类，以避免高估经序列确认的感染数量。
研究发现，商业qPCR与MAT之间的一致性仅为一般（κ = 0.30），突显了单纯依靠血清学不足以识别尿液中可检出钩端螺旋体DNA的犬只。在本研究中，31只商业qPCR阳性犬中仅有13只呈现MAT阳性滴度，这一差异与既往文献一致，证明了MAT在识别尿液中可检出钩端螺旋体DNA的犬只方面的局限性。
研究结论：本研究证实，在临床健康的流浪犬尿液中分子确认检出并系统发育分析了L. interrogans和L. borgpetersenii DNA，这为波斯尼亚和黑塞哥维那提供了首个基于序列的致病性钩端螺旋体种类分子特征描述。这突显了在采样时存在可检出致病性钩端螺旋体DNA的犬只，提示了潜在的环境污染风险，尽管细菌活力和持续尿路排菌尚未确定。最终，这些见解强调了地方公共卫生当局应在“One Health”框架下实施结构化监测策略的重要性，重点关注负责任的流浪犬种群管理和公众教育，以降低这种重要人兽共患病的潜在传播风险。
