《Animals》：Matrix Metalloproteinase-9 Concentration in Peritoneal Fluid of Horses with and Without Strongyle Infection
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圆线虫感染在马中普遍存在，并可导致具有临床意义的相关疾病，然而其相关的炎症反应至今仍未完全阐明。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）作为细胞外基质降解和炎症反应的关键介质，已被提出可作为多种马科动物疾病的生物标志物。本研究旨在探讨圆线虫感染是否与马
专业摘要翻译：
圆线虫感染在马中普遍存在，并可导致具有临床意义的相关疾病，然而其相关的炎症反应至今仍未完全阐明。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）作为细胞外基质降解和炎症反应的关键介质，已被提出可作为多种马科动物疾病的生物标志物。本研究旨在探讨圆线虫感染是否与马腹膜液（PF）中MMP-9浓度升高相关。研究共纳入83匹表现为疝痛、体重下降或粪便含水量增多的马匹，并通过联合沉淀-漂浮法对圆线虫感染进行半定量判定。研究人员采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别检测非抗凝及枸橼酸盐抗凝腹膜液样本中的MMP-9浓度，并应用非参数统计学检验进行分析。结果显示，非抗凝样本中的MMP-9测量值与枸橼酸盐抗凝样本的测量值呈显著强相关。在圆线虫阳性与阴性马匹之间，MMP-9浓度、有核细胞总数（TNCC）、总蛋白（TP）及乳酸水平均未观察到显著差异，不同粪便虫卵计数分级组间亦无显著差异。相比之下，MMP-9浓度与包括TNCC和TP在内的炎症参数呈显著正相关，且该相关性不受圆线虫感染状态影响。上述研究结果表明，腹膜MMP-9反映的是非特异性炎症过程而非圆线虫感染本身。关联性的缺失也可能反映了粪便虫卵计数及采样部位存在局限性，提示腹膜液并非检测寄生虫特异性炎症反应的最适样本。
论文解读文章
一、研究背景与问题提出
马匹在放牧过程中持续暴露于胃肠道寄生性圆线虫，圆线虫是马匹中最普遍且具有重要临床意义的寄生虫类群，包括小型圆线虫（杯口线虫）和大型圆线虫两大类。这类寄生虫具有复杂的生命周期，涉及环境和宿主体内多个发育阶段，在欧洲马群中广泛流行。尽管多数感染呈亚临床状态，但小型圆线虫和大型圆线虫均可引起显著疾病。特别是动脉圆线虫（Strongylus vulgaris）因其幼虫在动脉系统内迁移，可导致血管损伤和血栓栓塞性疝痛，具有高度致病性甚至可致死。杯口线虫幼虫则可进入发育停滞状态长达数月至三年，随后的大量幼虫同步 emergence 可导致严重的肠道病变和高死亡率。
目前推荐的寄生虫控制策略为选择性驱虫治疗，但标准粪便学检查技术无法对圆线虫虫卵进行种间区分，从而限制了对动脉圆线虫等高致病性虫种的识别，存在感染未被发现和治疗的显著风险。此外，抗驱虫药耐药性的不断增加进一步凸显了改进诊断工具的必要性。
基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种锌依赖性多结构域酶，负责降解细胞外基质（ECM）组分。MMP-9活性调控极为复杂，可被细胞因子、生长因子、激素及细胞接触等多种因素诱导或抑制。MMP-9降解细胞外基质成分及调节多种可溶性蛋白活性的能力，决定了其在生殖、生长、发育、炎症、血管及增殖性疾病等众多生理和病理过程中的重要作用。在其他线虫感染模型中，如旋毛虫属感染，血清MMP-9水平已被证实是可靠的炎症标志物。在马匹中，MMP-9活性升高见于反复气道阻塞、实验性脓毒症、肾脏损伤及溃疡性角膜炎等疾病。在疝痛马匹中，腹膜液MMP-9浓度被证实为脓毒症和内毒素血症的高诊断价值生物标志物。多项研究表明，在局部样本中检测MMP-9活性更为适宜。
尽管已有来自其他物种的证据支持寄生虫感染与MMP-9活性升高之间的关联，但马匹中寄生虫感染与MMP-9活性之间的关系此前尚未被研究。鉴于圆线虫感染的临床重要性以及MMP-9作为生物标志物的潜在价值，本研究分析了根据粪便虫卵排出有无分组的马匹腹膜液样本，假设圆线虫感染与腹膜液MMP-9浓度升高无关。
二、研究设计与主要结论
研究纳入了2021年春季至2022年秋季期间就诊于柏林自由大学马诊所的83匹马，所有马匹均表现出不同程度的疝痛、慢性体重下降或粪便含水量增多等临床症状。粪便检查显示60匹马圆线虫虫卵阴性，23匹阳性，其中低度感染11匹、中度感染2匹、高度感染10匹。非抗凝腹膜液样本来自78匹马，枸橼酸盐抗凝腹膜液样本来自49匹马，两种样本均有的马匹为44匹。
研究结果显示，在非抗凝腹膜液中，圆线虫阴性马匹的MMP-9浓度中位数为31.67 ng/mL，阳性马匹为31.86 ng/mL，两组间无显著差异。在枸橼酸盐抗凝样本中，阴性马匹中位数为13.91 ng/mL，阳性马匹为8.54 ng/mL，亦无显著差异。按粪便虫卵计数分级（阴性、低度、中度、高度）比较，MMP-9浓度在非抗凝和枸橼酸盐抗凝腹膜液中均无统计学显著差异。有核细胞总数（TNCC）、总蛋白（TP）和乳酸浓度在圆线虫阳性和阴性马匹之间以及不同虫卵计数分级之间均无显著差异。
然而，MMP-9浓度与炎症参数之间存在显著正相关。在枸橼酸盐抗凝腹膜液中，MMP-9与TNCC呈强正相关（ρ=0.645），与TP呈强正相关（ρ=0.675）；在非抗凝腹膜液中，MMP-9与TNCC呈强正相关（ρ=0.618），与TP呈中度正相关（ρ=0.325），与乳酸呈弱正相关（ρ=0.272）。这些相关性不受圆线虫感染状态影响。
在样本保存方式比较方面，非抗凝与枸橼酸盐抗凝腹膜液MMP-9浓度呈显著正相关（ρ=0.712），排除低于检测限的样本后相关性增强（ρ=0.856）。Lin一致性相关系数（CCC）为0.848，表明两种样本类型间具有良好一致性。Bland-Altman分析显示平均偏倚为25.5 ng/mL，95%一致性界限为-186.8至+237.7 ng/mL，表明在个体样本中配对测量值之间可能出现较大差异。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：联合沉淀-漂浮法用于粪便虫卵检测和半定量分级，该方法对蠕虫虫卵检测具有高灵敏度；马特异性MMP-9酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒用于定量检测非抗凝和枸橼酸盐抗凝腹膜液中的MMP-9浓度，检测范围为0.25-24 ng/mL；常规腹膜液分析包括有核细胞总数、总蛋白和乳酸测定；统计学分析采用Shapiro-Wilk检验和Kolmogorov-Smirnov检验评估数据正态性，应用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、独立样本t检验和单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，采用Spearman秩相关分析评估变量间关联，并应用Lin一致性相关系数和Bland-Altman分析评估两种样本类型间的一致性。样本来源为柏林自由大学马诊所就诊的83匹临床患马。
四、研究结果分述
4.1 研究人群特征
研究纳入83匹马，涵盖36个品种，其中德国运动马占13.3%，冰岛马占12.0%最为常见。研究群体包括26匹母马、4匹公马和53匹去势公马，中位年龄为12岁。粪便检查确定60匹阴性、23匹阳性。
4.2 腹膜液MMP-9浓度比较
在圆线虫阳性和阴性马匹之间，非抗凝腹膜液（p=0.852）和枸橼酸盐抗凝腹膜液（p=0.551）中的MMP-9浓度均无显著差异。按粪便虫卵计数分级比较，非抗凝腹膜液（p=0.878）和枸橼酸盐抗凝腹膜液（p=0.615）中的MMP-9浓度亦无显著差异。
4.3 两种样本类型间MMP-9相关性
Spearman相关分析显示非抗凝与枸橼酸盐抗凝样本MMP-9浓度显著正相关（ρ=0.712，p<0.001），排除低于检测限样本后相关性增强（ρ=0.856）。回归模型解释59.9%的方差，回归方程为y=55.11+0.76x。Lin一致性相关系数为0.848，Bland-Altman分析平均偏倚25.5 ng/mL，95%一致性界限为-186.8至+237.7 ng/mL，高浓度区间变异增大。
4.4 腹膜液有核细胞总数
圆线虫阴性马匹TNCC中位数为0.86×109/L，阳性马匹为0.77×109/L，无显著差异（p=0.735）。不同虫卵计数分级组间TNCC亦无显著差异（p=0.355）。
4.5 腹膜液总蛋白
圆线虫阳性马匹TP平均值为1.35 g/dL，阴性马匹为1.43 g/dL，独立样本t检验显示寄生虫状态对TP浓度无显著影响（p=0.941）。不同虫卵计数分级组间TP浓度无显著差异。
4.6 腹膜液乳酸
圆线虫阴性马匹乳酸浓度中位数为1.1 mmol/L，阳性马匹为1.40 mmol/L，无显著差异（p=0.809）。Kruskal-Wallis检验显示不同虫卵计数分级组间乳酸浓度无显著差异。
4.7 MMP-9与炎症参数的相关性
枸橼酸盐抗凝腹膜液中，MMP-9与TNCC（ρ=0.645，p<0.001）和TP（ρ=0.675，p<0.001）呈强正相关，与乳酸呈中度相关但不显著（ρ=0.303，p=0.141）。非抗凝腹膜液中，MMP-9与TNCC（ρ=0.618，p<0.001）和TP（ρ=0.325，p=0.014）呈显著正相关，与乳酸呈弱显著正相关（ρ=0.272，p=0.035）。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，粪便虫卵阳性与腹膜液MMP-9浓度之间缺乏关联可能反映多种因素。粪便虫卵计数存在显著异质性，同一匹马不同天数或同一天内不同样本间的虫卵数量可能变异较大。粪便虫卵计数不一定反映实际寄生虫载量，对寄生虫参与疾病过程的信息提供有限。虫卵排出在个体内和个体间均存在显著变异，杯口线虫的发育停滞现象可导致活动性感染时无虫卵排出。此外，粪便虫卵计数主要代表肠腔内的成虫阶段，无法反映在宿主组织内迁移的幼虫阶段。圆线虫虫卵在属和种水平上形态学无法区分，阳性虫卵计数无法提供杯口线虫或大型圆线虫存在的信息，也无法特异检测动脉圆线虫等临床重要虫种。因此，粪便虫卵计数与MMP-9浓度之间缺乏可检测的关联可能反映方法学局限性而非生物学关系的真实缺失。
腹膜液可能并非检测圆线虫感染相关MMP-9变化的最佳生物学基质。腹膜液与腹腔器官解剖学关系密切，多种肠壁疾病可改变其组成。研究纳入的马匹均表现出疝痛、体重下降或粪便含水量增多等临床症状，其他导致临床症状的胃肠道病理过程可能对腹膜液MMP-9浓度的影响强于圆线虫感染本身，可能掩盖寄生虫诱导炎症引起的轻微变化。缺乏健康对照组是研究的额外局限性。在幼虫迁移发生的肠壁组织内直接检测MMP-9可能能揭示感染与非感染马匹之间的差异，但腹穿刺比肠壁全层活检创伤性小得多。腹膜液中的潜在稀释效应也可能掩盖可测量的差异。
有证据表明寄生虫感染可能调节免疫反应并降低MMP-9浓度。旋毛虫肌幼虫排泄分泌产物处理的大鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎诱导后表现出较轻的临床症状，提示寄生虫来源产物可能具有免疫调节作用并可能减弱炎症反应。然而，胃肠道寄生虫感染的免疫反应仍未完全阐明，其效应可能因寄生虫种类、感染负荷和宿主免疫状态而异。
圆线虫阳性马匹数量相对较少，特别是中度感染组，在统计效力方面构成局限性。虫卵排出水平分布不均、数据变异性高及异常值存在可能降低了检测显著差异的能力。非正态数据分布进一步复杂化了统计分析，II型错误（未能检测到实际存在的效应）的可能性需加以考虑。
近期研究显示住院期间发生全身炎症反应综合征（SIRS）的马匹腹膜液TNCC、TP和乳酸浓度显著高于未发生该综合征的马匹。既往研究亦报道SIRS与MMP-9浓度升高相关。本研究结果与这些观察一致，MMP-9浓度与TNCC、TP和乳酸等炎症参数相关，且不受马匹寄生虫状态影响。MMP-9浓度已被证明与中性粒细胞百分比、TP和TNCC正相关，提示MMP-9主要反映中性粒细胞驱动的炎症过程。急性炎症状态如缺血或内毒素血症可能掩盖寄生虫感染的任何细微效应。
关于样本保存方式，非抗凝和枸橼酸盐抗凝腹膜液之间的显著正相关、良好一致性及最小系统偏倚表明枸橼酸盐抗凝对MMP-9测量的影响有限。枸橼酸盐抗凝在临床和科研环境中可能具有优势，因其通过螯合钙离子防止凝块形成，便于样本处理。然而，Bland-Altman分析显示较宽的一致性界限（-186.8至+237.7 ng/mL），表明个体样本中配对测量值之间可能出现显著差异，两种样本类型不应被视为完全可互换用于个体MMP-9测量。排除低浓度值后样本量从44降至26，提示相当比例的样本MMP-9浓度接近或低于检测限，这在腹膜炎症轻微或无炎症的马匹中可能相关。
研究结论为：本研究未发现马圆线虫粪便虫卵计数与腹膜液MMP-9浓度、TNCC、TP或乳酸之间存在关联，无论样本保存方式如何。圆线虫虫卵排出与腹膜MMP-9浓度之间缺乏关系提示粪便虫卵计数可能不能充分反映寄生虫负荷及腹腔内寄生虫诱导的炎症过程。相反，MMP-9水平与已确立的炎症标志物正相关，表明其主要反映中性粒细胞驱动的炎症而非圆线虫内寄生虫的虫卵排出强度。这些结果突出了使用粪便虫卵计数作为寄生虫相关病理替代指标的重要局限性，并提示腹膜液可能并非检测寄生虫特异性炎症反应的最适腔室。未来研究应侧重于受控实验设计，并在可行情况下纳入肠壁组织的直接评估，以更好地阐明MMP-9在寄生虫-宿主相互作用中的作用。对这些机制的深入理解可能有助于阐明马胃肠道寄生虫复杂且潜在双向的免疫调节效应。
