《Healthcare》：Biological Effects of Advanced Platelet-Rich Fibrin+ (A-PRF+)-Conditioned Medium on Primary Equine Corneal Stromal Cells: A Proof-of-Concept Study
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角膜创面愈合在很大程度上依赖于基质成纤维细胞的活化，这些细胞协调细胞外基质重塑和组织再生。尽管改良型富血小板纤维蛋白（advanced platelet-rich fibrin，A-PRF+）已在再生医学中展现出作为前景生物材料的潜力，但其对马角膜成纤维细胞的
角膜创面愈合在很大程度上依赖于基质成纤维细胞的活化，这些细胞协调细胞外基质重塑和组织再生。尽管改良型富血小板纤维蛋白（advanced platelet-rich fibrin，A-PRF+）已在再生医学中展现出作为前景生物材料的潜力，但其对马角膜成纤维细胞的生物学效应仍知之甚少。本研究从角膜基质外植体中分离原代马角膜成纤维细胞，并以A-PRF+条件培养基进行处理。研究人员采用比色法、荧光成像、流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估了细胞代谢活性、活力、细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）、创面愈合、细胞周期进程、生长因子分泌及I型胶原表达。A-PRF+显著增强了成纤维细胞的代谢活性，增加了细胞内ROS的产生，加速了创面闭合和细胞周期再进入，并刺激了血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子-A（VEGF-A）的分泌。此外，该处理提高了I型胶原阳性成纤维细胞的比例，支持了细胞外基质产生的增强。综上所述，这些发现证明A-PRF+通过刺激原代马角膜成纤维细胞的代谢、增殖、迁移和分泌活性而对其产生有益效应。这些结果为基于A-PRF+的眼用滴剂作为改善马角膜愈合的再生策略提供了实验依据。
论文解读文章
一、研究背景与目的
角膜损伤和马浅表性非愈合性角膜溃疡是影响马匹的最常见眼科疾病之一。角膜愈合修复是一个高度协调的生物学过程，涉及上皮细胞增殖与迁移、上皮与细胞外基质的再附着以及细胞分化。局部给予自体或异体血液制品，包括血清、血浆和血小板浓缩物，已被作为马多种角膜疾病的辅助治疗手段进行研究，以期增强角膜愈合。
血小板浓缩物中，富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代自体血小板浓缩物，通过无抗凝剂的全血离心获得，形成三维纤维蛋白基质。在纤维蛋白支架内，血小板逐渐释放生长因子，而白细胞则有助于调节炎症并分泌支持组织修复和再生的细胞因子。改良型富血小板纤维蛋白（advanced platelet-rich fibrin，A-PRF）和改良型富血小板纤维蛋白Plus（advanced platelet-rich fibrin plus，A-PRF+）采用改良的低速离心方案制备，可增加纤维蛋白基质中血小板、白细胞和生物活性分子的保留量，其中A-PRF+比常规A-PRF提供更高的细胞含量，从而实现更持久的生长因子释放和更优的再生潜力。
尽管这些血液衍生物已在体外和体内被评估对马角膜细胞及马和驴角膜创面愈合的影响，但现有证据仍然有限且存在矛盾结果。临床证据支持血小板浓缩物用于角膜疾病的情况日益增多，但结果仍不一致。在人类、小动物和驴中，局部应用富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）已被证明能显著加速角膜上皮创面愈合，但马匹中尚无对照临床研究，且由于方法学局限性，现有证据仍不足以推荐PRP作为标准治疗。标准PRF（standard PRF，s-PRF）滴眼液在驴中的应用及PRF凝胶在家兔中的应用未能显著改善实验性角膜创面愈合，而A-PRF凝胶在驴实验性诱导的角膜溃疡中有效促进了角膜愈合并控制了眼表感染。体外研究也显示了血浆富生长因子（plasma rich in growth factors，PRGF）的再生潜力，但比较性体外研究表明不同血小板衍生制品的生物学效应因其组成和制备方案而异。
基于研究人员先前在皮肤来源的原代成纤维细胞中证明马A-PRF+再生潜力的发现，本研究将该研究扩展至原代马角膜成纤维细胞。通过探索A-PRF+在不同组织特异性细胞模型中的生物学活性，旨在拓宽其潜在的再生应用，同时进一步阐明其促再生效应背后的生化机制。因此，本研究旨在体外研究马A-PRF+条件培养基对原代马角膜基质细胞（equine corneal stromal cells，ECSCs）的促再生效应，评估细胞代谢活性、迁移能力、细胞周期进程和细胞内ROS水平，并检测选定生长因子的分泌和I型胶原的表达，以研究其对细胞外基质重塑和细胞生化反应的潜在影响。
二、主要关键技术方法
研究人员从两匹马（一匹18岁成年马和一匹5日龄幼驹）获取眼球并分离角膜组织，通过外植体培养法建立原代马角膜成纤维细胞，细胞使用至第3至第6代。A-PRF+制备采用无抗凝剂真空采血管采集5匹健康马全血，以200×g离心8分钟获得，随后将血凝块置于无血清DMEM中37°C孵育3天制备条件培养基，使用前以1:4稀释。研究采用的主要技术方法包括：MTT比色法评估细胞代谢活性；Calcein-AM/PI双染评估细胞活力；DCFH-DA荧光探针定量细胞内ROS；流式细胞术进行细胞周期分析和I型胶原表达检测；体外划痕实验评估创面愈合能力；酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测PDGF-BB、TGF-β1和VEGF-A分泌水平。所有实验均使用来自两匹独立供体马的原代ECSCs，每个供体使用三个不同细胞代次在独立日期进行实验，共产生六个实验重复。
三、研究结果
3.1 原代马角膜成纤维细胞样细胞的分离与鉴定
角膜外植体培养约两周后，贴壁细胞从基质组织碎片中迁出并在外植体周围形成集落。相差显微镜显示细胞具有典型的细长梭形形态和扁平外观，符合成纤维细胞样细胞特征。荧光显微镜显示细胞质中清晰的波形蛋白信号，流式细胞术进一步确认了同质的波形蛋白阳性细胞群，几乎所有门控细胞均表达波形蛋白，支持其间充质和成纤维细胞样表型。
3.2 A-PRF+促进细胞代谢活性和细胞内ROS产生
MTT实验显示，经A-PRF+条件培养基处理24小时后，成纤维细胞代谢活性显著增强，达到无血清对照的214.32±11.25%，显著高于10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）组（160.02±8.61%）。Calcein-AM/PI活细胞染色显示A-PRF+组活细胞数量更多，未见明显碘化丙啶阳性细胞。DCFH-DA染色显示A-PRF+处理显著增加细胞内ROS水平至35606.40±2715.21 a.u.，显著高于无血清对照组（26011.40±1950.82 a.u.）和10% FBS组（28271.20±2224.66 a.u.）。
3.3 A-PRF+促进体外创面闭合和细胞周期再进入
划痕实验显示，72小时后无血清饥饿细胞几乎保留整个创面区域（残余面积100.00±3.31%），10% FBS组残余创面面积降至20.17±4.58%，而A-PRF+处理组残余创面面积进一步降至9.35±2.82%，显著低于无血清对照组和10% FBS组。细胞周期分析显示，A-PRF+处理显著降低G0/G1期细胞比例，同时增加S期和G2期细胞比例，与10% FBS组效果相当，表明A-PRF+促进细胞从静止状态向增殖阶段转变。
3.4 A-PRF+刺激生长因子分泌和I型胶原表达
ELISA分析显示，A-PRF+处理显著增强与组织修复相关的生长因子释放：PDGF-BB分泌从无血清对照的337.7±93.7 pg/mL增加至1298.0±140.5 pg/mL，TGF-β1水平从22.9±8.3 pg/mL增加至63.3±1.6 pg/mL，VEGF-A从51.3±4.0 pg/mL增加至79.1±2.0 pg/mL。流式细胞术分析显示，A-PRF+处理后I型胶原阳性细胞比例从无血清对照的35.8±2.4%增加至51.8±3.8%。
四、讨论与结论
研究人员指出，本研究作为探索性概念验证研究，将来自五匹供体马的条件培养基合并使用以提供统一制剂。总体而言，A-PRF+促进了协调的细胞反应，涉及代谢活性增加、体外创面闭合、细胞周期进展、生长因子释放和I型胶原表达，这些结果既证实又扩展了先前在皮肤成纤维细胞中的观察。与皮肤成纤维细胞研究不同，本研究将A-PRF+的生物学相关性扩展至角膜基质背景，因为角膜基质细胞活化和细胞外基质重塑是角膜创面修复的重要组成部分，而其失调可能导致基质瘢痕形成和角膜透明度受损。
研究人员强调，A-PRF+相比其他血小板浓缩物具有多项优势：无需抗凝剂或外源性凝血剂，允许天然纤维蛋白聚合；使用无添加剂的玻璃管或经认证的无添加剂塑料管制备可避免硅胶微粒污染。然而，PRF凝块和可注射PRF（injectable PRF，I-PRF）必须制备后立即使用，这对需要每日多次重复给药的眼科应用构成实际限制。在此背景下，A-PRF+条件培养基可能代表一种实用替代方案，允许给予标准化富集生物活性生长因子的制剂，同时避免新鲜PRF的操作限制。
研究也存在局限性：生物学供体数量有限，两匹供体代表截然不同的年龄组，研究设计无法专门评估供体年龄的贡献。尽管两匹供体观察到的反应一致，但未来需要纳入更多不同年龄组的供体以更好地表征个体间变异。此外，这些效应是否转化为有效的角膜再生并保持正常基质结构，仍需体内研究确认。
研究结论指出，源自异体A-PRF+的条件培养基可促进原代马角膜成纤维细胞的特定生化反应，其特征为早期代谢活化、受控ROS生成、增强的创面闭合、细胞周期再进入以及生长因子释放和I型胶原表达增加。这些发现扩展了先前在马皮肤成纤维细胞中获得的观察结果，表明A-PRF+的生物学活性不仅限于特定组织来源，还能影响临床相关的ECSCs。A-PRF+可溶性因子在无外源血清条件下刺激成纤维细胞功能的能力，突显了其作为角膜修复生物支持手段的潜力，特别是在创面愈合早期阶段促进细胞迁移和再生反应方面。然而，仍需进一步研究确定这些发现的临床相关性，并评估A-PRF+是否在保持基质结构和光学透明度的同时支持组织恢复，而不诱导过度纤维化或持续性瘢痕形成。
