日粮姜黄素添加水平对57~84日龄中速型肉鸡回肠形态、抗氧化状态及Nrf2表达的剂量-效应评价

《Healthcare》：Dose–Response Evaluation of Dietary Curcumin Supplementation on Ileal Morphology and Antioxidant Status in Broiler Chickens

　　

本研究旨在评估在57~84日龄中速型肉鸡饲喂实用型玉米-豆粕日粮条件下，改善肠道形态和抗氧化状态适宜的日粮姜黄素添加水平。共252只雄性肉鸡（57日龄；1092.86 ± 8.91 g）随机分为6个日粮处理组，每组7个重复笼，每笼6只。肉鸡饲喂添加0、80、160、240、320或400 mg/kg姜黄素的日粮28 d。拟合渐近模型、折线模型和二次模型于剂量-效应数据，以估计适宜的日粮姜黄素添加水平。姜黄素添加改善了回肠形态和抗氧化状态，表现为绒毛高度（VH）、VH/隐窝深度（CD）、绒毛表面积、总抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，同时CD和丙二醛（MDA）含量降低。姜黄素还上调过氧化氢酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）₁、GPX₃、GPX₄及核因子E2相关因子2（Nrf2）的mRNA表达，并增加Nrf2蛋白丰度。在候选模型中，折线回归对关键回肠抗氧化指标拟合最佳，表明在本试验条件下，约188 mg/kg日粮姜黄素可能足以最大化回肠总抗氧化能力。此外，Nrf2表达呈现与抗氧化相关基因表达及抗氧化酶活性相似的趋势，但与MDA含量呈相反趋势。这些发现提示Nrf2表达与肠道抗氧化状态之间可能存在关联。

研究背景与目的：自饲料中禁用抗生素促生长剂以来，天然、促进健康的饲料添加剂受到关注。姜黄素（curcumin）是姜黄来源的生物活性多酚，具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗菌等作用。肉鸡肠道健康是生理稳态和生产性能的重要决定因素，充足抗氧化防御对维持肠道结构和功能完整性至关重要。已有研究显示日粮姜黄素可改善肉鸡生长性能、调节肠道菌群、增强免疫、维持肠道完整性和屏障功能、改善肉品质；姜黄素纳米颗粒也可改善肠道健康。然而，姜黄素添加与肠道抗氧化反应之间的剂量-效应关系尚未系统表征，基于肠道抗氧化标准的适宜添加水平仍待估计。Nrf2是抗氧化酶和细胞保护基因表达的重要转录调节因子，但姜黄素剂量依赖与Nrf2相关抗氧化调控关系尚不清楚。研究采用源于略阳黑骨鸡母系和广西灵山地方黑羽鸡父系的杂交黑骨肉鸡，兼具黑骨鸡色素特征和较好生长性能与饲料效率，研究人员假设适宜水平姜黄素可改善肠道形态和抗氧化能力并与增强Nrf2相关抗氧化反应有关。研究评估0、80、160、240、320或400 mg/kg姜黄素对57~84日龄中速型肉鸡回肠形态、抗氧化相关酶、氧化产物、抗氧化相关基因表达及Nrf2相关反应的影响，并用剂量-效应模型估计适宜添加水平。结论：姜黄素改善回肠形态和抗氧化状态，约188 mg/kg可能足以最大化回肠总抗氧化能力；提示Nrf2表达与肠道抗氧化状态可能存在关联，姜黄素可作为潜在天然饲料添加剂。意义：为年龄和日粮特异添加水平提供参考，并整合形态、抗氧化和Nrf2蛋白评价。

关键技术方法：选用1日龄350只雄性黑骨肉鸡（江苏省家禽科学研究所，扬州，中国；略阳黑骨鸡×广西灵山地方黑羽鸡杂交后代），1~56日龄饲喂基础日粮；57日龄选252只（1092.86±8.91 g）随机分6个日粮处理，每处理7个重复笼、每笼6只，分别添加0、80、160、240、320、400 mg/kg姜黄素28 d。84日龄取样，取回肠中段固定用于H&E（苏木精-伊红）组织形态测定，刮取回肠黏膜用于抗氧化指标、基因和蛋白分析。采用商业试剂盒测定丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）；RT-qPCR（反转录定量聚合酶链反应）检测过氧化氢酶（CAT）、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）₁、GPX₃、GPX₄和核因子E2相关因子2（Nrf2）mRNA，β-actin为内参，2^?ΔΔCT法计算；Western blot（蛋白质印迹）检测Nrf2蛋白。统计采用单因素ANOVA（方差分析）、LSD（最小显著差法）、Pearson相关、正交对比，并拟合渐近、折线和二次模型估计适宜添加水平。

3.1 回肠组织形态：通过H&E组织形态计量，日粮姜黄素显著影响隐窝深度（CD）、绒毛高度（VH）、VH/CD和绒毛表面积（VSA）（p < 0.0001）。随添加水平升高，CD在160 mg/kg前显著降低后稳定；VH和VH/CD显著升高并在160 mg/kg最高；VSA在160 mg/kg最大，之后显著下降；各指标呈显著线性和二次效应。结论：姜黄素改善回肠形态，160 mg/kg附近效果明显。

3.2 回肠T-AOC、MDA含量及SOD活性：通过商业试剂盒，姜黄素显著影响T-AOC、MDA和SOD（p < 0.01）。T-AOC和SOD随添加升高在160 mg/kg最大后无进一步改善；MDA在160 mg/kg最低后不变；T-AOC和SOD线性二次升高，MDA线性二次降低。结论：姜黄素增强回肠抗氧化能力并降低脂质过氧化。

3.3 mRNA表达水平：通过RT-qPCR，姜黄素显著影响抗氧化相关基因（p < 0.02）。SOD、GPX₃、GPX₄ mRNA在80 mg/kg达最大；CAT和Nrf2在160 mg/kg达峰后稳定；GPX₁在320 mg/kg最大。SOD、GPX₁、GPX₃、GPX₄和Nrf2呈线性和二次增加，CAT仅二次反应。结论：姜黄素上调抗氧化相关基因和Nrf2 mRNA。

3.4 蛋白表达水平：通过Western blot，姜黄素显著影响回肠黏膜Nrf2蛋白（p < 0.0001），在160 mg/kg最大后稳定，并呈显著线性和二次反应。结论：姜黄素增加Nrf2蛋白表达。

3.5 相关性分析：用Pearson相关热图，多数抗氧化相关指标和抗氧化相关基因表达与Nrf2 mRNA及蛋白变化模式相似，MDA呈相反模式。结论：Nrf2表达与肠道抗氧化状态呈潜在关联。

3.6 适宜日粮姜黄素添加水平估计：用渐近、折线和二次模型拟合T-AOC、MDA、SOD剂量-效应数据。渐近模型估计分别为206.159、212.461、84.613 mg/kg日粮；折线模型为187.572、139.465、167.934 mg/kg日粮；二次模型为303.979、273.826、281.184 mg/kg日粮。结论：本试验条件下约188 mg/kg可能足以最大化回肠T-AOC。

讨论部分指出，中国自2020年7月起全面禁用饲料抗生素，植物源添加剂因低毒和广谱生物活性受关注。肠道形态指标中CD反映上皮细胞周转，VH、VSA和VH/CD反映吸收能力；本研究结果与部分研究一致，但Zhang et al.报道姜黄素增加回肠CD且对CAT、SOD活性和MDA无显著影响，Guo et al.报道对回肠T-AOC、MDA、SOD和CAT无显著影响，差异可能源于肉鸡基因型、年龄、日粮组成、姜黄素剂量和试验时长。T-AOC反映组织整体抗氧化能力，MDA是脂质过氧化标志；姜黄素增加T-AOC和SOD、降低MDA，上调SOD、CAT、GPX₁、GPX₃、GPX₄及Nrf2 mRNA，增加Nrf2蛋白，Nrf2与抗氧化酶相似、与MDA相反，提示姜黄素诱导的抗氧化调控可能与Nrf2相关信号有关。研究扩展在于针对57~84日龄中速型肉鸡，整合回肠形态、抗氧化状态和Nrf2蛋白，并比较三种回归模型提供年龄和日粮特异估计。剂量-效应关系多为线性二次（CAT仅二次）；折线模型对T-AOC、MDA、SOD的R²最高，估计范围139.465~187.572 mg/kg，与既往有效水平相当；断点提示高添加水平抗氧化反应接近平台，Yadav et al.报道谷胱甘肽和总谷胱甘肽在高水平趋于稳定，Abdel-Moneim et al.观察到姜黄素纳米颗粒后MDA和SOD的剂量依赖变化。局限为β-actin稳定性未独立验证，抗氧化相关基因表达结果需谨慎解释。

结论部分翻译：日粮姜黄素添加改善了57~84日龄肉鸡回肠形态和肠道抗氧化状态。这些改善伴随抗氧化酶活性增加以及与Nrf2信号相关的抗氧化相关基因表达上调，提示其可能参与抗氧化防御。基于估计的断点（约139~188 mg/kg）和总体抗氧化反应，在本试验条件下，约188 mg/kg活性姜黄素可能是支持肠道抗氧化状态的适宜水平。这些发现提示姜黄素具有作为天然饲料添加剂以支持肉鸡肠道健康和抗氧化防御的潜力。