同源四倍体太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）40 K液相SNP芯片“LuDongLiXin-4N-I”的开发及其在群体遗传、基因组选择与GWAS中的验证

《Aquaculture Reports》：Development and validation of a 40?K liquid SNP array in autotetraploid Pacific oyster ( Crassostrea gigas)

　　

同源四倍体太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是一种重要经济物种，在三倍体C. gigas生产中发挥关键作用。分子标记对牡蛎选择育种至关重要，但同源四倍体C. gigas缺乏高效、高通量基因分型平台，限制了遗传改良。本研究中，研究人员利用靶向测序基因分型（GBTS）平台，开发了全球首个用于同源四倍体C. gigas的40 K液相单核苷酸多态性（SNP）芯片，命名为“LuDongLiXin-4N-I”。该SNP芯片包含41,270个高质量SNP，并表现出较高的个体检出率（97.55%）和测序深度（241.20 X）。基于该SNP芯片，3个群体被清晰区分，4种方法获得一致的聚类结果。对于壳高（0.470）、壳长（0.605）、壳宽（0.520）和总重（0.581），6种基因组预测模型（Bayes A、Bayes B、Bayes C、Bayes Lasso、GBLUP和RKHS）获得相近的高预测准确率。此外，基于全基因组关联分析（GWAS），鉴定出52个与生长性状相关的SNP和候选基因。总之，全球首个SNP芯片“LuDongLiXin-4N-I”为同源四倍体C. gigas提供了高效、经济且稳健的基因分型平台。“LuDongLiXin-4N-I”的应用为构建高质量同源四倍体C. gigas群体和选育改良品种提供了新技术途径，并为同源四倍体C. gigas养殖产业的高效和可持续发展奠定了重要基础。

研究背景：牡蛎是全球重要养殖经济贝类，C. gigas是中国北方常见养殖种。夏季繁殖后，其性腺指数和抗逆性下降，易导致大量死亡，并造成肉质和营养品质下降。同源四倍体可与二倍体杂交产生三倍体C. gigas；三倍体多数夏季不释放精卵，软体饱满，可缓解夏季高死亡率并提高生长与性腺指数。为稳定生产三倍体，需构建同源四倍体C. gigas群体。目前主要依靠系谱构建，周期长，且部分性状测定可致死亡，不利于优质种质资源保护，因此需发展新育种策略。单核苷酸多态性（SNP）标记及基因组选择（GS）、全基因组关联分析（GWAS）已用于经济贝类遗传改良。多倍体SNP calling较二倍体要求更高测序深度和更严格策略，现有测序策略难以兼顾准确与经济，限制了GS和GWAS评估。靶向基因分型中，SNP芯片具有低成本、高通量、高测序深度和可更新等优点；二倍体牡蛎已有SNP芯片，但同源四倍体C. gigas尚未见芯片。靶向测序基因分型（GBTS）已用于植物和少数水产种，但未用于C. gigas。因此，研究人员开发并验证全球首个同源四倍体C. gigas 40 K液相SNP芯片“LuDongLiXin-4N-I”，并评估其在群体遗传、GS和GWAS中的应用价值，以期为高效选择育种和优质群体构建提供工具。

主要关键技术方法：样本队列来源为山东烟台KongTongDao Industrial Co., LTD提供的300只1.5龄同源四倍体C. gigas，用于重测序；408只验证群体亦来自该公司，其中Group 1（207只）和Group 2（125只）为Kongtong Island耐低氧群体诱导同源四倍体后F₁、F₂群体，Group 3（76只）为山东烟台长岛耐热群体诱导同源四倍体后群体。主要技术包括全基因组重测序筛选SNP，MOLO策略选SNP并设计110 bp探针，基于GBTS构建液相芯片；用Fastp、BWA-mem、SAMTOOLS和sentieon进行质控、比对和变异检测；用主成分分析（PCA）、判别分析主成分（DAPC）、邻接（NJ）树和STRUCTURE分析群体结构；用rrBLUP和BGLR拟合GBLUP、RKHS及Bayes A、Bayes B、Bayes C、Bayes Lasso，10折交叉验证评估预测准确率；用GWASpoly进行GWAS，Bonferroni和suggestive阈值筛选，SnpEff注释候选基因。

研究结果：3.1 SNP选择与“LuDongLiXin-4N-I”SNP芯片开发：重测序获得43,819,157,470 raw reads和43,764,993,334 clean reads，平均测序深度（DP）32.48 X；鉴定2,104,038个SNP，选择52,320个高质量SNP设计探针，最终开发含41,270个位点的SNP芯片。3.2 SNP位置信息统计：SNP距离主要集中于1–15 Kb（74.88%），以1–5 Kb最高（39.11%）；多数位于intronic、intergenic和exon区域，较少位于up/downstream和UTR；转换占56.90%，转换/颠换比（Ti/Tv）约为1.32。3.3 “LuDongLiXin-4N-I”SNP芯片基因分型性能：平均DP为241.20 X，多数位点位于50–200 X（48.45%），50–100 X区间有8455个位点；99.5%个体检出率在96%–99%，平均97.55%；93.02%位点缺失率低于10%，51.44%无缺失；38,327个位点（92.87%）最小等位基因频率（MAF）>0.05；期望杂合度（He）多数为0.600–0.875（85.04%）。3.4 群体结构分析：37,760个高质量SNP用于分析；PCA前两主成分分别解释7.3%和3.4%，Group 1与Group 2部分重叠，Group 3明显分离；DAPC前两判别轴解释80.3%和19.7%，三组清晰分开；NJ树形成三个主要分支；K=3时结构分析与预定义群体对应，部分个体显示混合祖先。3.5 遗传力和预测准确率分析：遗传力（h²）为0.26–0.53，SH、SW、SL为中等遗传力（0.26–0.33），TW最高（0.53）；SH、SW、SL的σ²_u<σ²_e，TW的σ²_u>σ²_e；六种模型预测准确率为SH 0.470（0.468–0.474）、SL 0.605（0.600–0.612）、SW 0.520（0.518–0.520）、TW 0.581（0.577–0.583），模型间差异较小，表明芯片可用于基因组估计育种值（GEBV）预测且表现稳定。3.6 全基因组关联结果：Bonferroni阈值下，SL和TW分别鉴定5个和14个显著SNP，SH和SW无显著SNP；suggestive阈值下，SH、SL、SW、TW分别鉴定5、8、6、14个SNP；结果部分称鉴定52个最接近SNP的候选基因，讨论部分统计为19个显著和33个提示性SNP、共52个SNP，并注释19个与SL和TW显著相关基因。SL相关g20865（Dual specificity protein phosphatase 3）和g12902（SLIT-ROBO Rho GTPase-activating protein 1）涉及细胞增殖、分化和矿化；TW相关g11769（Malate dehydrogenase）影响能量代谢，g12417（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 13）调控PI3K-AKT通路。

讨论部分总结：原文讨论将“LuDongLiXin-4N-I”的个体检出率与“NingXin-III”“Xiexin No. 1”“Dongxin-I”等芯片比较，显示其97.55%的检出率较高且稳定；93.02%位点缺失率低于10%，低于“Xiexin No. 1”和“Baoxin-I”的相应比例，但仍需进一步优化位点；高缺失率可能与探针杂交不稳定或侧翼拷贝数变异有关。MAF主要分布于0.3–0.5（28,106个位点，68.10%），He主要分布于0.600–0.875（85.04%），表明多态性和信息量较高。群体结构分析中，PCA、DAPC、NJ树和STRUCTURE结果一致，Group 3分化较强，Group 1和Group 2部分重叠，原文认为可能与共同祖先、历史连通或渐渗有关。TW遗传力高于SH、SL和SW，六种模型预测准确率稳定，说明芯片适用于GS。生长相关SNP分布于所有染色体而非单一区域，提示生长性状可能受多基因微效调控；原文讨论与P. fucata、Salmo salar及C. gigas × C. angulata等报道相似，并与Wang et al.、Yang et al.、Meng et al.、Zhao et al.、Li et al.、Xiang et al.等研究相呼应。候选基因涉及MAPK、Rho GTPase、钙和碳酸氢盐转运、糖基化及壳沉积等过程，为解析同源四倍体C. gigas生长机制提供方向。

研究结论部分翻译：本研究基于GBTS平台，首次开发了用于同源四倍体C. gigas的40 K液相SNP芯片“LuDongLiXin-4N-I”。该芯片包含41,270个高质量SNP，均匀分布于10条染色体；平均个体检出率为97.55%，SNP缺失率为2.45%，平均DP为241.20 X。遗传分析表明，该芯片可有效解析群体结构、准确预测经济性状育种值，并鉴定与性状相关的显著SNP和候选基因。“LuDongLiXin-4N-I”为同源四倍体C. gigas遗传改良和分子育种提供了高效、经济且稳健的工具。合理应用该芯片将促进优质同源四倍体C. gigas群体构建，并在优良性状三倍体C. gigas生产中发挥重要作用。