L-天冬酰胺酶II的p.V27A变异体在最大限度降低谷氨酰胺酶活性的同时，不影响其抗白血病功能

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：The p.V27A variant of l-asparaginase II minimizes glutaminase activity without compromising anti-leukemic function

　　• p.V27A突变触发了结构致密化并增加了α-螺旋含量。• 该突变体表现出增强的抗变性热力学稳定性。• p.V27A使谷氨酰胺的Km值升高近一倍。• 通过重塑活性位点柔性环来优化底物特异性。• 针对Jurkat T-ALL细胞的强效抗白血病功效得以完全保留。引言L-天冬酰胺酶（L-天冬酰胺酰胺水解酶，EC 3.5.1.1）是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）及其他造血系统恶性肿瘤的基石化疗药物[1]、[2]。天冬酰胺酶（ASNase）的治疗疗效依赖于其催化氨基酸L-天冬酰胺（Asn）水解为L-天冬氨酸和氨的能力。正常体细胞能够通过天冬酰胺合成酶（ASNS）内源合成Asn，而白血病淋巴母细胞通常表现出较低的ASNS基础表达水平和/或有限的代偿能力以应对胞外Asn的耗竭。因此，这些恶性细胞对外源Asn的依赖性更强，更容易受到ASNase诱导的Asn耗竭的影响[3]–[7]。ASNase对循环中Asn的酶促耗竭会严重抑制这些易感细胞的蛋白质合成，最终触发细胞凋亡[3]、[4]、[8]。目前临床上使用源自大肠杆菌（EcA2）和丁香假单胞菌的酶制剂[3]、[8]。天然大肠杆菌ASNase于1978年首次获得FDA批准，但长期以来受限于血浆半衰期短和免疫原性高[9]。1990年代开发的聚乙二醇化制剂（pegaspargase）通过延长半衰期和遮蔽免疫原表位显著改善了这些问题[9]–[11]。然而，对于对大肠杆菌来源变体产生超敏反应的患者，丁香假单胞菌来源的ASNase仍是主要替代选择[9]、[10]。尽管疗效显著，ASNase治疗常伴随严重的非血液学毒性，包括肝毒性、胰腺炎、高血糖和凝血障碍。越来越多的证据表明，这些不良反应是由该酶的次级L-谷氨酰胺酶活性驱动的[12]。EcA2具有双重底物特异性：它能高效水解Asn（Km在低μM范围），同时也能催化L-谷氨酰胺（Gln）水解为谷氨酸和氨，但催化效率较低（Km在低mM范围）[13]–[15]。由于循环中Gln浓度比Asn高出几个数量级，即使是低效率的谷氨酰胺转化也能产生大量氨，从而加重代谢毒性并引起高氨血症[16]。因此，工程化无谷氨酰胺酶活性的变体已成为结构生物学领域优先解决的问题，以改善该药物的治疗指数。近年来，为最小化脱靶谷氨酰胺酶活性，研究重点集中在活性位点柔性环（ASFL）上，这是一种动态结构基序（第11–31位残基），充当催化口袋的门控元件[16]–[19]。在无配体结合状态下，该环保持柔性且无序；结合底物后，它采用闭合构象，正确定位催化亲核试剂Thr12[16]、[19]。在2018年的一项计算机分子动力学和QM/MM研究中，Ardalan等人最初提出，通过V27T突变引入极性侧链可以抑制谷氨酰胺酶活性，同时保留天冬酰胺酶功能[20]。Strzelczyk等人（2022年）随后通过实验验证了这一预测，解析了EcA2 (V27T)与L-Asp和L-Glu复合物的晶体结构，证明V27T保留完整的野生型天冬酰胺酶活性，同时使谷氨酰胺酶转化速率降低四倍[16]。在平行的一项计算研究中，Ardalan等人（2021年）模拟了一个大体积芳香族突变V27F，预测空间位阻拥挤和阳离子-π相互作用会选择性降低对体积较大的L-谷氨酰胺底物的亲和力。然而，该变体尚未经过实验表达或验证[17]。虽然先前的计算和实验研究专注于引入极性（V27T）或大体积芳香族（V27F）侧链[16]、[17]、[20]，但第27位残基位阻减少的结构和功能后果仍未被探索。直观来看，缩小侧链体积可能会扩大口袋或增加环柔性，从而可能容纳体积更大的谷氨酰胺底物[16]。为验证位阻截断是否反而机械性地重塑环的堆积和门控动力学，我们对V27位进行丙氨酸突变（V27A）。值得注意的是，临床批准的EcA2-4M治疗酶中就包含Ala27，此外还有三个替代突变（N64D、S252T和T263N），它们共同调节活性和稳定性[21]。近期比较研究表明，这些联合突变共同影响催化特性、底物特异性和构象稳定性[21]；然而，由于它们同时发生，无法仅从临床变体推断V27A的独立贡献。本文在等基因EcA2-K12背景中分离并表征了单一p.V27A变体，综合采用生物物理光谱、差示扫描量热法、稳态动力学、分子动力学模拟和体外细胞毒试验，以阐明这一门控位点位阻减少如何独立地调节环动力学和底物辨别能力。各节摘要化学试剂1-氨基萘-8-磺酸（ANS）、氨苄青霉素、链霉素、奈斯勒试剂和尿素购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、β-巯基乙醇（β-ME）、乙二胺四乙酸（EDTA）、α-乳糖及其他常规试剂购自Merck（德国达姆施塔特市）。克隆与定点突变表达质粒pET101/D-TOPO（Invitrogen），含大肠杆菌ansB基因（NCBI参考序列：NC_000913.243），由教授慷慨提供。p.V27A突变体的构建与纯化本研究的主要目标是通过对活性位点柔性环（ASFL）进行工程化来调节底物特异性。通过定点突变成功将p.V27A突变引入大肠杆菌ansB基因。如图S5所示，PCR扩增获得一条预期大小的单一清晰条带。随后Sanger测序确认第27位丙氨酸密码子被精确引入，且未产生非预期的次级突变（图1B）。野生型（WT）与突变体（MT）的……讨论源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶（EcA2）仍然是急性淋巴细胞白血病（ALL）管理的基石治疗药物。然而，其临床疗效常受到剂量限制性非血液学毒性（尤其是肝毒性和神经毒性）的损害，这些毒性主要由该酶的次级L-谷氨酰胺酶活性驱动。本研究的核心理论前提是，EcA2的底物特异性受活性位点柔性环的构象动力学控制。结论总之，本研究确立了对活性位点柔性环（ASFL）进行理性工程化是优化大肠杆菌L-天冬酰胺酶治疗特性的一种高效策略。通过引入p.V27A突变，我们成功诱导了全局性结构致密化，其特征是α-螺旋含量增加以及溶剂暴露疏水表面积减少。这种构象收紧不仅显著增强了该酶的……CRediT作者贡献声明Sarvenaz Moradi：初稿撰写、软件、调查研究、形式分析、数据管理。Elaheh Bahrami：形式分析。Mohammad Bagher Shahsavani：审阅与编辑、可视化、软件、形式分析。Saeid Bouzari：审阅与编辑。Mahdi Karimi：形式分析。Zahra Bahrami：形式分析。Saeideh Bagheri：审阅与编辑。Ludovico Pipitò：审阅与编辑、形式分析。Giuseppe Deganutti：审阅与编辑、形式……利益冲突作者声明与本文内容不存在利益冲突。致谢衷心感谢德黑兰大学和伊朗国家科学基金会（INSF）的财政支持（项目编号：96010387）。作者名单：Sarvenaz Moradi | Elaheh Bahrami | Mohammad Bagher Shahsavani | Saeid Bouzari | Mahdi Karimi | Zahra Bahrami | Saeideh Bagheri | Ludovico Pipitò | Giuseppe Deganutti | Ali Akbar Saboury | Ali Akbar Moosavi-Movahedi | Reza Yousefi