富含特级初榨橄榄油的饮食对患有妊娠糖尿病倾向的后代母羊子宫内膜的影响

《Archives of Medical Research》：Impact of an Extra Virgin Olive Oil-enriched Diet in Diabetic Dams on the Decidua of offspring Prone to Gestational Diabetes

　　**背景**
在怀孕早期，蜕膜支持胚胎的发育以及母亲对妊娠的适应。母体糖尿病会导致后代出现妊娠糖尿病（GDM），而子宫内的氧化应激环境也起着重要作用。富含特级初榨橄榄油（EVOO）的饮食可以提供抗氧化作用。本研究假设，在孕前患有糖尿病的雌性大鼠（F0）中给予富含EVOO的饮食，会对其早期妊娠的后代（F1）的蜕膜产生有益影响，因为这些后代容易发展成GDM。

**目的**
评估9天妊娠的糖尿病大鼠后代蜕膜中的信号通路和氧化应激状态标志物，这些大鼠的母亲在F0妊娠期间要么接受了含有6% EVOO的饮食，要么没有接受这种饮食。

**方法**
在F0妊娠期间，轻度糖尿病患者和对照组大鼠分别被喂食含有或不含6% EVOO的饮食，然后对其9天妊娠的后代进行评估。研究分析了蜕膜的功能标志物（催乳素、PPAR通路和mTOR通路）以及氧化应激状态。

**结果**
尽管母体的血糖和孕酮水平正常，但糖尿病大鼠后代的蜕膜中催乳素和mTOR通路的活性降低，而调节这些通路的microRNA水平升高。F0代大鼠接受的富含EVOO的饮食未能阻止这些变化。糖尿病大鼠后代的蜕膜中FABP4（参与蜕膜化过程并且是氧化应激状态的标志物）和脂质过氧化的水平也升高。而富含EVOO的饮食则防止了这些变化的发生。

**结论**
母体糖尿病会损害早期妊娠后代的蜕膜化标志物和氧化应激状态。这些变化部分可以通过给予富含EVOO的饮食得到改善。

**引言**
有大量证据表明，包括妊娠糖尿病（GDM）在内的母体糖尿病与后代代谢疾病的发展有关（1,2）。氧化应激和炎症反应的环境以及由此产生的表观遗传变化被认为是导致代谢疾病发展的原因（2,3）。GDM妊娠的特点是子宫内的氧化应激和炎症反应环境，这通过胎盘的变化得到体现，胎盘是母亲对妊娠适应、胎儿发育和胎儿编程的关键器官（3,4）。使用非遗传性糖尿病实验模型的研究有助于我们理解这些发育编程的机制。在我们的实验室中，我们详细研究了通过新生儿链脲佐菌素诱导的轻度糖尿病大鼠模型。这种孕前糖尿病（F0）模型表现出胚胎、胎儿和胎盘的损伤，以及胎儿的代谢和心脏功能障碍（5, 6, 7）。有趣的是，这些孕前糖尿病大鼠的后代（F1）在三个月大时血糖正常，但若与健康雄性交配后会发展成GDM（8）。这些大鼠在妊娠晚期发展成GDM的事实使我们能够在易于发生GDM的大鼠模型中研究妊娠早期情况。这有助于了解母体糖尿病史对GDM发生前蜕膜的潜在影响。

**妊娠过程**
着床后，一系列关键事件开始发生，滋养层细胞侵入蜕膜。蜕膜（也称为妊娠子宫内膜）是在着床后早期嵌入并滋养发育中的胚胎和胎盘的组织（9,10）。越来越多的研究强调了妊娠早期和蜕膜功能在妊娠适应和胚胎发育中的重要作用，这一阶段的损伤与后代的长期不良后果相关（2）。蜕膜化是一个复杂的过程，涉及一系列信号通路，这些通路触发对滋养层侵袭的适当反应，并在母体-胚胎界面产生所需的激素、免疫和代谢通路（9,10）。蜕膜的生成和对催乳素的响应在这一过程中起关键作用，而脂肪酸结合蛋白4（FABP4）这种参与细胞内脂质转运的蛋白质与蜕膜化相关（11,12）。另外两个与蜕膜化相关的信号通路是过氧化物酶体增殖活化受体（PPAR）通路和雷帕霉素机械靶点（mTOR）通路。这些通路相互作用，为蜕膜提供适当的组织营养，并调节子宫内的氧化应激和炎症反应环境（3,13,14）。mTOR通路通过其复合物1（mTORC1）触发磷酸化级联反应，这对蛋白质合成、生长和发育所需的营养功能至关重要（14,15）。核糖体蛋白S6（rpS6）和4E结合蛋白1（4E-BP1）是mTORC1激活的下游效应物，参与蛋白质合成的上调（13,15）。三种PPAR亚型（PPARα、PPARγ和PPARδ）具有代谢和发育功能，并能刺激抗氧化和抗炎通路（16,17）。它们的表达受到不同microRNA（miRs）的严格调控，这些miRs分别靶向每种PPAR亚型（18）。实际上，miR-19b负调节PPARγ，miR-122负调节PPARδ，miR-21负调节PPARα在不同组织中的表达（19, 20, 21）。值得注意的是，这些miR参与蜕膜化过程，它们的失调与炎症和代谢病理有关（19,22, 23, 24）。PPARs是一类由多种脂质配体激活的转录因子（16）。这些配体可以通过饮食获得，从而通过PPAR激活产生营养基因组效应（25）。富含特级初榨橄榄油（EVOO）的饮食通过其主要成分单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸以及具有强抗氧化特性的多酚提供营养基因组效应（26,27）。已有研究表明，富含EVOO的饮食对不同的代谢、炎症和心血管疾病具有多种益处（26,28,29）。此外，这些饮食可以减少GDM的发生和胰岛素需求，并降低GDM患者胎盘中的抗氧化和抗炎标志物水平（30, 31, 32）。在糖尿病和妊娠的动物模型中，富含EVOO的饮食对发育中的胚胎、胎儿和胎盘有积极作用（33, 34, 35）。此外，这些饮食还能改善后代的代谢和心脏功能障碍（6,7）。最近我们发现，富含EVOO的饮食可以防止糖尿病大鼠青春期前后代子宫内的蜕膜化异常（36）。在本研究中，我们关注妊娠早期，并假设在这种实验模型中，糖尿病大鼠后代在妊娠晚期GDM发生之前，参与蜕膜化和正常蜕膜功能的通路已经受损。因此，本研究旨在评估催乳素、PPAR和mTOR通路，并确定9天妊娠的后代蜕膜中的氧化应激状态标志物，这些后代的母亲在F0妊娠期间要么接受了含有6% EVOO的饮食，要么没有接受这种饮食。

**材料与方法**
白化Wistar大鼠在我们机构的动物设施（CEFYBO-CONICET-UBA）中繁殖，并在12小时光照/12小时黑暗的周期下饲养。它们可以自由摄取商业大鼠饲料（GEPSA，布宜诺斯艾利斯，阿根廷）。实验动物护理和使用机构委员会（CICUAL；决议CD N° 554/2021；阿根廷大学医学院）批准了该实验方案，该方案符合美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK54050/?report=reader）。

如图1所示，通过在2天大的新生儿身上皮下注射链脲佐菌素（STZ，90 mg/kg；Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国），溶于0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 4.5；Sigma-Aldrich，美国），诱导了F0代大鼠的轻度糖尿病模型（5,37）。对照组动物仅接受柠檬酸缓冲液。在3个月大的雌性大鼠交配前确认其糖尿病状态。空腹血糖水平超过130 mg/dL的被视为糖尿病大鼠。这些轻度糖尿病大鼠的空腹血糖范围为140–250 mg/dL，而对照组低于110 mg/dL。对照组和糖尿病组的雌性大鼠都与健康的成年雄性大鼠交配，成功交配通过阴道涂片中的精子存在得以确认。该糖尿病模型的生殖特征已先前被研究过（5）。

对照组和糖尿病大鼠从妊娠第一天开始直至分娩都喂食标准饮食或补充6% EVOO的饮食（Natura，AGD，阿根廷）（每组6–8只）。这些饮食在之前的研究中已经过评估（6），包括不含或含有6% EVOO的商业多用途大鼠饲料（GEPSA，布宜诺斯艾利斯，阿根廷），其成分如下：
i) 标准饮食的成分（g/100 g）：碳水化合物（50），蛋白质（25），脂肪（5）；主要脂肪酸：16:0（0.58），18:0（0.16），18:1 n-9（1.27），18:2 n-6（1.99），18:3 n-3（0.73）；
ii) 含6% EVOO的饮食的成分（g/100 g）：碳水化合物（48），蛋白质（24），脂肪（11）；主要脂肪酸：16:0（1.55），18:0（0.26），18:1 n-9（5.77），18:2 n-6（2.41），18:3 n-3（0.57）。这两种饮食都是低脂的，满足维持生命和繁殖所需的卡路里、脂肪和蛋白质需求。分娩后，F0代大鼠及其断奶后的后代（F1）可以自由摄取商业多用途大鼠饲料（GEPSA，布宜诺斯艾利斯，阿根廷）。与之前的报道类似（6），这种含有EVOO的饮食并未改变F0代大鼠的血糖（F0代大鼠在妊娠第21天的血糖值：F0对照组：97 ± 3 mg/dL；F0对照组-EVOO饮食：81 ± 3 mg/dL；F0糖尿病组：155 ± 44 mg/dL；F0糖尿病-EVOO饮食：163 ± 44 mg/dL）。这种孕前糖尿病模型（F0）在F1代雌性与健康雄性交配时会导致其后代在三个月大时发展成GDM（8）。GDM可以在足月妊娠中发生，即使母亲在妊娠期间接受富含EVOO的饮食（33）。在本研究中，我们评估了容易发展成GDM的F1代。来自对照组和糖尿病大鼠的3个月大雌性后代（每组6–8只F1代）与健康雄性交配，并在妊娠着床后第9天进行研究。

在妊娠第9天，F1代大鼠在CO2培养箱中安乐死，其子宫被转移到含有Krebs-Ringer溶液（120 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，25 mM NaHCO3，1.2 mM NaH2PO4，5.5 mM D-葡萄糖）的Petri皿中。血糖使用分光光度酶法测定（Wiener Lab，罗萨里奥，阿根廷）。血清孕酮水平使用电化学发光免疫测定法（ECLIA）在Cobas 6000分析仪（Roche Diagnostics，曼海姆，德国）上进行测定。使用立体显微镜和显微手术工具从子宫中提取与着床部位对应的蜕膜团块。然后在立体显微镜下打开每个蜕膜团块以确定其中是否含有植入的胚胎。如果蜕膜中没有植入的胚胎，则记录为吸收。计算每个实验组中的吸收和植入胚胎的数量。吸收率通过将胚胎吸收的数量除以总的着床部位数量来计算。为了进一步分析，我们评估了与植入胚胎对应的蜕膜。每个蜕膜被取出并在-80°C下保存，用于后续的Western blot和RT-qPCR研究。

**Western blot分析**
对于Western blot分析，将100 mg的蜕膜混合液在冰冷的缓冲液D溶液（250 mM蔗糖，10 mM HEPES-Tris，pH 7.4）中匀浆，该缓冲液含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）。混合液来自每个实验组中不同窝的6–8只F1代大鼠的植入胚胎对应的蜕膜团块。匀浆液中的蛋白质（25 μg）通过SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上（35 V恒压，4°C过夜）（13）。膜用Ponceau S染色剂染色（Sigma-Aldrich）以确定总蛋白含量并确认均匀加载和转移。在室温下用1%牛血清白蛋白（BSA）在TBS-Tween中封闭1小时。然后将膜与1% BSA在TBS-Tween中的初级抗体孵育过夜（4°C）。使用Cayman Chemical Company（密歇根，美国）的初级抗体来确定PPARδ（1:100稀释度）、PPARγ（1:200稀释度）和PPARα（1:200稀释度）的蛋白表达。使用Cell Signaling Technology（MA，美国）的初级抗体来确定总蛋白和磷酸化4E-BP1（1:1,000稀释度）及总蛋白和磷酸化rpS6（1:1,000稀释度）的蛋白表达。用TBS清洗后，膜与过氧化物酶结合的二级抗体孵育（1:10,000）。使用ECL检测溶液（Thermo Scientific，MA，美国）进行可视化。使用化学发光成像系统（GeneGnome XRQ，Syngene）捕获了一张图像，并使用ImageJ软件（NIH，MD，美国）进行了密度分析。同时测量了相应车道中Ponceau S染色的颜色强度。目标蛋白的表达量被归一化到总蛋白水平（目标蛋白/总蛋白）。从每只母鼠植入胚胎对应的蜕膜球中提取了100毫克的总RNA（每个实验组中有6-8只怀孕后代[F1]，来自不同的窝）。总RNA浓度通过NanoDrop分光光度计测定。通过将2微克提取的RNA与随机引物六聚体（Promega，WI，美国）在72°C下孵育5分钟来合成cDNA。然后，加入含有MMLV逆转录酶400 U（Promega）和四种dNTP（Invitrogen）的反应混合物。按照先前的描述，混合物在37°C下孵育60分钟，然后在72°C下孵育15分钟（36）。cDNA被定量并用于在含有dNTP混合物（Solis BioDyne）、GoTaq聚合酶（Promega）、EvaGreen 20x（Biotium，CA，美国）和基因特异性引物（见补充表1）的反应缓冲液中的扩增。qPCR条件包括在95°C下进行5分钟的变性步骤，随后是40个循环的变性、退火和引物延伸。mRNA水平被归一化到18S核糖体RNA和60S核糖体蛋白L30的几何平均值。在每个循环中，通过使用CFX-96 Real-Time System C1000 Touch Thermal Cycler（Bio-Rad，加利福尼亚，美国）测量荧光来监测PCR扩增的过程。然后使用2–ΔΔCt方法量化所评估的mRNA的表达量。相对mRNA水平以相对于对照组的倍数变化表示。

从每只母鼠植入胚胎对应的蜕膜球中提取了100毫克的总RNA（每个实验组中有6-8只怀孕后代[F1]，来自不同的窝），使用RNAzol?（MCR Inc.，OH，美国）。总miR浓度通过NanoDrop分光光度计测定。在总RNA提取之前，先加入合成型cel-miR-39（20 fmol）。简要地说，将10微克的miR和0.07 μM的茎环引物在70°C下预加热5分钟。接着，加入含有400 U的MMLV逆转录酶（Promega）和5X MMLV缓冲液（Promega）的反应混合物。然后，加入每种dNTP 10 mM（Invitrogen）。混合物在37°C下孵育60分钟，随后在72°C下孵育15分钟，如先前报道的那样（36）。cDNA在含有dNTP混合物（Solis BioDyne）、GoTaq聚合酶（Promega）、EvaGreen 20x（Biotium，CA，美国）以及补充表1中描述的基因特异性引物的反应缓冲液中扩增。qPCR条件包括在95°C下进行5分钟的变性步骤，随后是40个循环的变性、退火和引物延伸。microRNA水平被归一化到cel-miR-39。每个循环中的PCR扩增过程通过使用CFX-96 Real-Time System C1000 Touch Thermal Cycler（Bio-Rad，加利福尼亚，美国）进行荧光测量来监测。然后使用2–ΔΔCt方法量化所评估的microRNA的表达量。相对microRNA水平以相对于对照组的倍数变化表示。

在9天妊娠的大鼠蜕膜中，对FABP4和4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE，一种脂质过氧化的标志物）进行了免疫染色（38）。每个实验组使用了来自每只母鼠植入胚胎对应的两个蜕膜球，以及6到8只怀孕后代（F1），来自不同的窝。每个蜕膜被石蜡包埋并连续切片（5 μm）。所得切片用二甲苯脱蜡并通过一系列分级乙醇溶液重新水化。为了阻断内源性过氧化物酶的活性，将切片在0.3% H2O2中孵育20分钟。然后，将切片在室温下与适当的初级抗体孵育过夜：抗FABP4（兔多克隆抗体，1:100稀释，Abcam，美国）和抗4-HNE（兔多克隆抗体，1:75稀释，Abcam，美国），如先前描述的那样（13）。初级抗体在含有1% BSA的TBS-Tween中稀释。阴性对照以两种方式进行：一种是没有初级抗体的情况，另一种是用含有各种IgG亚类的同种血清代替初级抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA，美国）。接下来，应用1:200稀释度的生物素化的山羊抗兔IgG抗体在PBS-Tween中，其中含有1.5%正常 horse serum（Vector Laboratories），然后与avidin-biotin复合物孵育60分钟。通过加入3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物显色剂缓冲液加上0.02%（v/v）过氧化氢在0.05 M Tris（pH 7.6）中孵育10分钟来显色。最后，切片被洗涤、脱水、用二甲苯透明处理并安装。两位对实验条件不知情的经验丰富的观察者使用光学显微镜（Nikon Eclipse E200）检查切片并拍照（Nikon DS-Fi1）。免疫反应强度使用ImageProPlus软件进行量化。数据相对于1的值显示，该值被赋值为未补充组的平均值。

数据以平均值±SEM表示。使用Levene检验测试方差的一致性，并使用Shapiro-Wilk检验评估变量分布的正态性，然后进行ANOVA分析。使用双向ANOVA比较各组，随后根据需要使用Bonferroni事后检验或χ2检验。使用GraphPad Prism Version 8软件（GraphPad，Inc.，San Diego，CA，美国）。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。

在本研究中，我们检查了在早期植入后阶段的怀孕大鼠的后代（F1代），这些大鼠的母亲在F0妊娠期间被喂食了添加或不添加EVOO的饮食。在妊娠第9天，糖尿病大鼠的后代（F1，糖尿病组），尽管其母亲在F0妊娠期间被喂食标准饮食或富含EVOO的饮食，均表现出正常血糖（表1）。这些后代易于在妊娠后期发展成妊娠糖尿病（GDM）。讨论
这项关于糖尿病大鼠后代的研究揭示了在早期植入后阶段，由于宫内暴露于轻度糖尿病，这些后代的蜕膜化和功能标志物受损。这一阶段对胎盘和胚胎的正常发育以及后代的长期健康至关重要（2,9）。
正如预期的那样，糖尿病大鼠的9天妊娠后代表现出正常血糖，因为在3个月大的怀孕大鼠中，妊娠后期会出现高血糖。

在DOHaD框架内，我们发现了与蜕膜化和蜕膜功能相关的通路的不利编程，以及在容易发展为GDM的孕前糖尿病大鼠的9天妊娠后代的蜕膜中存在促氧化状态。这些改变包括催乳素、FABP4、PPARs、miR和mTOR通路的变化。尽管母体血糖正常，这些变化仍然在糖尿病母鼠后代的蜕膜中被观察到。这种情况发生在蜕膜...

Cintia Romina Gatti|Sabrina Lorena Roberti|Verónica Montero|Florencia Schibert|Virginia Soledad Taylor|Romina Higa|Alicia Jawerbaum