miR-2c靶向Notch2与FAM166B并调控合浦珠母贝生物矿化相关及细胞调控过程

《Fishes》：miR-2c Targets Notch2 and FAM166B and Regulates Biomineralization-Associated and Cellular Regulatory Processes in the Pearl Oyster Pinctada fucata martensii

　　

摘要 MicroRNA-2c（miR-2c）此前已被认为参与合浦珠母贝（Pinctada fucata martensii）的贝壳形成，但其更广泛的下游调控网络仍不清楚。本研究对体内miR-2c过表达（M2，n = 3）、抑制（I2，n = 3）及阴性对照处理（NC，n = 4）后的外套膜组织进行了RNA测序（RNA sequencing）。在NC与M2、NC与I2以及I2与M2三组比较中，分别鉴定出121、82和242个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。对合并DEG集的功能富集分析突出了生物矿化相关过程，包括几丁质与氨基糖代谢、细胞外基质组织，以及更广泛的细胞调控通路。通过表达响应互逆性及野生型/突变型双荧光素酶报告实验，FAM166B和Notch2被鉴定为miR-2c的额外直接靶基因；Notch2的Western blot描述性结果与该调控关系一致。先前确立的LncMPEG1–miR-2c调控关系也被延伸至这些新靶基因。上述发现拓展了已知的miR-2c调控网络，并将miR-2c、Notch2和FAM166B鉴定为未来功能及群体水平遗传学研究的候选调控位点。然而，这些转录组响应应在实验设计的背景下加以解读，包括使用单一共用养殖池以及选取响应强烈的个体进行RNA-seq；仍需进一步重复实验以确定这些响应的普遍性。

miR-2c调控合浦珠母贝生物矿化与细胞过程的转录组学解析

一、研究背景与科学问题

软体动物贝壳是由外套膜调控下通过生物矿化形成的碳酸钙外骨骼，是软体动物的重要演化创新。尽管碳酸钙构成贝壳的主要矿物成分，但贝壳的成核、晶体生长和结构组织受到包括几丁质、贝壳基质蛋白和糖胺聚糖在内的有机基质组分的严格调控。这些组分由功能特化的外套膜上皮细胞合成和分泌，其区域分化有助于形成不同的贝壳结构。因此，贝壳生物矿化不仅受胞外矿物沉积的调控，还受外套膜中精细调控的细胞过程的影响。尽管已鉴定出大量参与贝壳形成的生长因子、信号分子和转录因子，但转录后调控仍相对缺乏了解。

MicroRNA（miRNA）是一类长度通常为18–25个核苷酸的小型非编码RNA，主要在转录后水平调控基因表达。越来越多的证据表明miRNA也是生物矿化的重要调控因子。miR-2家族是原口动物中进化保守的miRNA家族，其成员参与多种发育过程，部分通过对Notch和保幼激素相关信号通路的调控实现。在贝类中，血细胞也参与生物矿化：在合浦珠母贝中，循环和外套腔外血细胞含有富钙囊泡和CaCO₃晶体，参与钙转运和贝壳再生。

研究人员前期研究鉴定miR-2c为合浦珠母贝中与贝壳相关的miRNA，其在外套膜组织中相对高表达，在贝壳再生过程中响应，并在幼虫贝壳发育中呈现阶段特异性表达。体内操作进一步表明，改变miR-2c活性会影响棱柱层和珍珠层的形成。然而，前期工作主要集中于单个靶基因和特定调控轴，尚不清楚miR-2c扰动是否诱导外套膜中多个功能系统的协调响应。因此，研究人员假设改变miR-2c活性会诱导超越先前鉴定的贝壳形成基因的协调转录响应，涉及生物矿化相关和更广泛的细胞调控过程。为验证该假设，研究人员对miR-2c过表达和抑制后的外套膜组织进行转录组测序，随后进行功能富集、靶标预测和选定下游基因的实验验证，并进一步检验新鉴定靶标是否能纳入先前确立的LncMPEG1–miR-2c调控网络。

二、主要关键技术方法

研究人员从中国广东雷州流沙湾采集合浦珠母贝（壳长5–6 cm），在循环海水中驯化2天后，随机分为miR-2c过表达组（M2）、抑制组（I2）和阴性对照组（NC），每组8个个体，三组共同饲养于单一共用养殖池。注射72小时后收集外套膜套膜（MP）组织。选取M2和I2组中miR-2c表达变化最显著的各3个个体及4个NC个体进行RNA测序（Illumina NovaSeq 6000平台，PE150），数据经fastp过滤后以HISAT2比对至合浦珠母贝参考基因组（GCA_002216045.1），以StringTie重构转录本、RSEM定量基因表达，DESeq2分析差异表达（FDR < 0.05，|log2FC| > 1）。采用miRanda预测miR-2c靶向结合位点。通过双荧光素酶报告实验验证miR-2c与FAM166B和Notch2 3′UTR的直接相互作用，Western blot描述性检测Notch2蛋白丰度，并通过LncMPEG1过表达和体内dsRNA敲降实验检验其对新靶基因的调控。

三、研究结果

3.1 外套膜对miR-2c过表达和抑制的转录组响应

RNA测序获得每文库5.82–7.34 Gb的清洁数据，总比对率为70.27%–73.22%。以FDR < 0.05和|log2FC| > 1为阈值，NC与M2比较鉴定出121个DEGs（M2相对NC上调84个、下调37个），NC与I2比较鉴定出82个DEGs（I2相对NC上调40个、下调42个），I2与M2比较鉴定出242个DEGs（M2相对I2上调136个、下调106个）。PCA显示PC1和PC2分别解释17.38%和12.58%的总方差，三组存在部分重叠，若干生物学重复显示较大离散度。对合并DEG集的功能富集分析显示，排名靠前的GO类别包括几丁质代谢过程、含葡糖胺化合物代谢过程、氨基糖代谢过程、氨基聚糖代谢过程、细胞外基质结构组分和结构分子活性等生物矿化相关类别，以及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号、胰岛素受体信号、激素和胰岛素响应、细胞迁移和运动调控等细胞调控类别，同时存在免疫相关类别。

3.2 miR-2c候选下游靶标的鉴定与验证

研究人员利用miRanda评估六个选定的生物矿化相关DEGs（HOXA1、engrailed-2、Runx/Runt、Notch2、FAM166B和MMP）3′UTR中的潜在miR-2c结合位点，所有六个候选均包含最小自由能低于?12 kcal/mol的预测位点。Runx/Runt已在先前研究中被验证为miR-2c的直接靶标，engrailed/MMP分支已在先前LncMPEG1–miR-2c网络中表征。本研究聚焦于额外候选HOXA1、Notch2和FAM166B。FAM166B和Notch2因在miR-2c过表达后表达下降、抑制后表达上升，呈现符合经典miRNA介导负调控的互逆表达响应而被优先进行实验验证。双荧光素酶报告实验表明，miR-2c mimics与相应野生型3′UTR报告载体共转染显著降低相对荧光素酶活性，而突变预测的miR-2c结合位点则消除了抑制效应，证实FAM166B和Notch2是miR-2c的直接靶基因。HOXA1虽含有预测结合位点，但呈现相反转录响应，被保留为miR-2c响应候选基因但未进行双荧光素酶验证。

3.3 选定miR-2c响应基因的体内表达响应

RNA-seq与qRT-PCR比较显示，FAM166B和Notch2在两种平台中均呈现一致响应方向：miR-2c抑制后表达上升，过表达后表达下降，qRT-PCR显示与NC组相比差异显著（p < 0.05）。相反，HOXA1在miR-2c过表达后上升、抑制后下降（p < 0.05）。Western blot描述性结果显示，合并样本中Notch2蛋白丰度在miR-2c过表达后降低、抑制后升高，与转录水平和报告实验一致，但因每组仅一个合并蛋白样本，不构成独立重复的蛋白水平调控证据。

3.4 LncMPEG1调控新鉴定的miR-2c靶标FAM166B和Notch2

双荧光素酶报告实验中，miR-2c mimics与野生型报告载体共转染显著降低FAM166B和Notch2的相对荧光素酶活性，而同时过表达LncMPEG1则显著提高两种野生型报告载体的活性（p < 0.05），尽管仍低于相应对照组。突变miR-2c结合位点基本消除抑制效应。体内LncMPEG1敲降实验中，与dsRFP对照组相比，LncMPEG1敲降显著降低FAM166B表达（p < 0.05）并显著减少Notch2表达（p < 0.01）。由于未包含WT报告载体+LncMPEG1+NC mimic的对照，结果被解读为在LncMPEG1–miR-2c调控背景下对新靶标的调节作用，而非miR-2c依赖性拯救的确定性证据。

四、讨论总结

转录组数据支持对miR-2c响应网络的扩展视图。差异表达基因与几丁质和氨基糖代谢、细胞外基质结构功能、受体酪氨酸激酶信号、胰岛素和激素响应、磷脂酰肌醇和mTOR信号、细胞黏附及细胞迁移相关。基质相关类别与软体动物贝壳形成的分子复杂性一致，而信号和细胞类别与增殖、分化、代谢、组织组织和胞内调控相关。免疫、组织重塑和生物矿化在双壳类中生理上相互关联而非完全独立系统，miR-2c扰动诱导的广泛转录响应可能反映对贝壳形成所需细胞环境的调控，而非仅调控矿物沉积。

Notch2是获得最强支持的新信号节点。Notch信号是高度保守的细胞命运、增殖和分化调控因子。miR-2家族与Notch信号的密切关系已在昆虫中得到证实：飞蝗中miR-2/13/71簇在卵子发生过程中直接靶向Notch，家蚕中miR-2家族成员调控与Notch信号相关的awd和fng基因。本研究提供了直接分子证据：Notch2转录在miR-2c过表达后下降、抑制后上升，qRT-PCR确认相同表达模式，突变预测结合位点消除对Notch2 3′UTR报告载体的抑制效应，描述性Western blot显示相应蛋白丰度模式。这些数据将Notch2鉴定为miR-2c的直接下游靶标，并提示miR-2c可能部分通过Notch相关细胞调控影响贝壳形成外套膜组织。miR-2–Notch调控关系在昆虫和软体动物中的出现提示该调控连接可能在原口动物中进化保守。

FAM166B被鉴定为miR-2c的另一个直接下游靶标。其转录丰度在miR-2c过表达后下降、抑制后上升，双荧光素酶分析确认与其3′UTR的直接相互作用。结构研究将FAM166B鉴定为与轴丝双联微管及纤毛或鞭毛结构相关的微管内部蛋白，该功能可能与外套膜上皮生理相关，因为贝壳形成需要协调的细胞骨架组织、胞内运输、分泌和物质转运。FAM166B可能代表miR-2c调控网络中先前未表征的细胞组分，但其参与外套膜生理或贝壳形成仍属假设。HOXA1呈现不同响应，因未经验证与miR-2c的直接相互作用，更宜视为miR-2c响应基因而非直接靶标。

本研究还将先前确立的LncMPEG1–miR-2c调控关系延伸至新靶标。LncMPEG1过表达部分解除miR-2c介导的FAM166B和Notch2报告载体抑制，而LncMPEG1敲降降低两者体内表达。这些实验并未确立新的LncMPEG1–miR-2c竞争性内源RNA机制，而是表明先前定义的相互作用延伸至本研究鉴定的额外下游靶标。miR-2c网络更宜表示为分支调控系统而非单一线性通路。

五、结论翻译

本研究中，miR-2c扰动与合浦珠母贝选定外套膜样本中的转录响应相关，涉及生物矿化相关和更广泛的细胞调控过程。Notch2和FAM166B被鉴定为miR-2c的额外直接靶标；Notch2的描述性Western blot模式与该调控关系一致，但需独立生物学重复验证。先前确立的LncMPEG1–miR-2c关系也被延伸至这些靶标。这些发现拓宽了miR-2c的已知调控范围，并将miR-2c、Notch2和FAM166B鉴定为未来功能和群体水平关联研究的候选调控位点，尽管这些响应需使用独立生物学和养殖池重复进一步验证。