原位形成免疫调节水凝胶通过维持线粒体适应度重振耗竭CD8+ T细胞

《SCIENCE ADVANCES》：An in situ forming immunomodulatory hydrogel reinvigorates exhausted CD8+ T cells via preserving their mitochondrial fitness

　　

线粒体功能障碍驱动的CD8⁺ T细胞耗竭仍是有效肿瘤免疫治疗的主要障碍。在此，研究人员报道了一种基于d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）的原位形成水凝胶[多功能热敏复合凝胶（MTC Gel）]，其通过双途径策略保持线粒体适应度，从而重振耗竭的CD8⁺ T细胞。瘤内注射后，MTC Gel在生理温度下快速凝胶化并解离，产生高局部浓度的TPGS，后者靶向肿瘤细胞线粒体以触发促死亡线粒体自噬。该过程诱导强效免疫原性细胞死亡（ICD）并阻断隧道纳米管（TNTs）介导的线粒体劫持。同时，从MTC Gel释放的负载NLG919的杂化纳米粒协同恢复被吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）抑制的CD8⁺ T细胞线粒体生物发生。在多种小鼠肿瘤模型中，MTC Gel通过减少CD8⁺ T细胞耗竭并增强效应与细胞毒功能，重编程T细胞免疫，从而激发强效杀肿瘤活性。这些发现突显该合理设计的水凝胶系统作为下一代基于ICD的肿瘤免疫治疗的临床可转化平台。

肿瘤免疫治疗受免疫抑制性肿瘤微环境（TME，限制淋巴细胞浸润并富集抑制性细胞因子）制约，传统免疫原性细胞死亡（ICD，可激活抗肿瘤免疫的细胞死亡方式）诱导剂如多柔比星（DOX）和奥沙利铂（OXA）虽可释放损伤相关模式分子（DAMPs）并激活树突状细胞（DC），但存在非特异性细胞毒性和CD8⁺ T细胞功能耗竭等限制。肿瘤细胞还可通过隧道纳米管（TNTs，细胞间纳米管结构）向CD8⁺ T细胞转移去极化线粒体并劫持其功能线粒体，抑制T细胞氧化磷酸化（OXPHOS）；同时，吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1，色氨酸耗竭酶）过表达导致色氨酸耗竭并破坏CD8⁺ T细胞线粒体生物发生。基于此，研究人员将TPGS作为多功能生物活性剂，阐明其诱导ICD并阻断TNTs介导线粒体劫持的作用，进而构建原位形成热敏复合凝胶（MTC Gel），在多种小鼠肿瘤模型中评价其重振耗竭CD8⁺ T细胞和增强抗肿瘤免疫的能力。研究结论表明，MTC Gel通过保持线粒体适应度（mitochondrial fitness，涵盖线粒体质量和OXPHOS能力）重振耗竭CD8⁺ T细胞，并展现临床可转化平台潜力；论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

主要关键技术与方法：研究采用生物透射电镜（Bio-TEM）观察线粒体自噬结构，流式细胞术检测线粒体膜电位、活性氧（ROS）、免疫表型及线粒体转移，共聚焦/STED和场发射扫描电镜（FESEM）观察线粒体共定位、TNTs和肿瘤浸润，Seahorse分析氧消耗率（OCR）与备用呼吸能力（SRC），Western blot与免疫荧光检测Parkin/BNIP3/RHOT1/IDO1等，微流控制备NLG919杂化纳米粒（NHNs）和IL-12 mRNA脂质纳米粒（LNPs），并以DLS/TEM/cryo-SEM/流变学表征水凝胶；体内采用4T1、CT26、B16F10小鼠模型（BALB/c、C57BL/6；细胞系来源包括北京鼎国、苏州大学、上海交通大学等，小鼠购自北京斯贝福），结合IVIS、MRI、ELISA、ELISpot和转录组/KEGG/GO/GSEA分析。

研究结果：
TPGS induces robust ICD via eliciting prodeath mitophagy in cancer cells：通过Bio-TEM、流式细胞术、线粒体ROS和膜电位检测、共聚焦及Western blot等发现，TPGS在4T1细胞中诱导线粒体ROS积累、膜电位降低和Parkin/BNIP3通路介导的促死亡线粒体自噬，并以高于常规ICD诱导剂的水平促进钙网蛋白暴露及HMGB1、ATP释放，表明其作为非常规III型ICD诱导剂可强效诱导ICD。
TPGS blocks TNT-mediated mitochondrial hijacking to preserve CD8⁺ T cell mitochondrial metabolism：通过4T1与CD8⁺ T细胞共培养、FESEM、共聚焦和Seahorse分析发现，TPGS破坏TNTs结构并下调RHOT1，阻断肿瘤细胞对CD8⁺ T细胞线粒体的劫持，降低4T1细胞OCR并部分恢复CD8⁺ T细胞线粒体呼吸。
Rational design, preparation, and characterization of MTC Gel：通过盐析法制备TPGS基水凝胶并负载NHNs和DOX，经TEM、DLS、cryo-SEM、流变学和释放实验证实其具有生理温度下溶胶-凝胶转变、剪切变稀、多孔结构和持续释放DOX与NLG919的特性，并在体内逐渐降解。
Immunomodulatory and antitumor effects of MTC Gel in vitro：通过IFN-γ诱导IDO1的4T1-CD8⁺ T细胞共培养、流式细胞术、线粒体生物发生标志物和转录组分析发现，MTC Gel降低Kyn水平、增强CD8⁺ T细胞LAMP1表达和线粒体生物发生，并促进DAMPs释放、DC成熟和肿瘤细胞凋亡。
MTC Gel retards 4T1 primary tumor growth：通过4T1原位肿瘤模型、IVIS、肿瘤生长和生存分析、H&E与TUNEL染色发现，MTC Gel延长瘤内滞留、显著抑制原发肿瘤生长、减少凋亡阳性细胞并提高60天生存率至80%。
MTC Gel reinvigorates exhausted CD8⁺ T cells to elicit potent antitumor immune responses：通过流式细胞术、免疫荧光、ELISA和转录组分析发现，MTC Gel促进DC成熟和CD8⁺ T细胞活化，降低IDO1及Kyn/Trp比值、Treg和耗竭CD8⁺ T细胞比例，提高IFN-γ⁺效应和GzB⁺细胞毒CD8⁺ T细胞比例，并重塑免疫抑制TME。
MTC Gel elicits systemic immunity and synergizes with αPD-L1 to prevent tumor recurrence：通过双侧4T1、肺转移和肿瘤再挑战模型、IVIS、MRI、ELISpot和流式细胞术发现，局部MTC Gel可抑制远端肿瘤和肺转移，并与αPD-L1协同减少复发、提高生存率、增加脾脏中央记忆T细胞（Tcm）和肿瘤抗原特异性IFN-γ应答。
TPGS-based hydrogel serves as an expandable personalized platform for versatile cancer treatments：通过CT26结直肠癌和B16F10黑色素瘤模型、IL-12 mRNA LNPs及αPD-L1/αCTLA-4联合治疗发现，MTC Gel–O和MTC Gel–L可抑制肿瘤生长、改善生存、增强DC成熟和T细胞/NK细胞免疫，并抑制黑色素瘤肺转移，表明该平台具有可扩展性和个性化应用潜力。

讨论部分总结：研究人员发现TPGS可作为促死亡线粒体自噬相关ICD诱导剂，较常规内质网应激相关ICD诱导剂具有选择性靶向癌细胞线粒体、规避IRE1α相关免疫逃逸及通过Parkin/BNIP3降解RHOT1阻断线粒体劫持等优势；但TPGS抑制TNTs形成及下调Sec5的上游信号仍未完全明确。MTC Gel的抗肿瘤免疫由DC抗原提呈激活CD8⁺ T细胞、NLG919降低Treg和髓源性抑制细胞（MDSC）并促进肿瘤相关巨噬细胞（TAM）向M1表型极化、以及炎症细胞因子正反馈等多机制协同介导；与αPD-L1联合可建立长期免疫记忆并防止复发。其临床转化潜力来自美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生物相容性组分和个性化平台特性，可共载DOX、OXA或IL-12 mRNA LNPs，后者促进CD8⁺ T细胞和NK细胞活化并诱导IFN-γ。研究结论部分翻译：综上，研究人员提出一种简便且广泛适用的策略以重振瘤内耗竭CD8⁺ T细胞，有助于增强免疫治疗疗效；鉴于线粒体功能在抗肿瘤免疫中的关键作用，越来越多靶向线粒体的两亲性材料被开发；该原位形成水凝胶的配制过程相对简单且易于放大，凸显其作为转化型基于ICD的肿瘤免疫治疗平台的潜力；未来可与新兴线粒体死亡诱导剂联合以进一步增强抗肿瘤免疫治疗疗效。