LCK 调节神经母细胞瘤中的细胞凋亡和细胞间通讯网络

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：LCK Regulates Apoptosis and Intercellular Communication Networks in Neuroblastoma

　　

•LCK重塑转移性神经母细胞瘤的免疫通讯•多柔比星直接结合LCK并诱导细胞凋亡•位于1p32-35的LCK是治疗靶点和生物标志物

## 引言

神经母细胞瘤是儿童最常见的实体恶性肿瘤，起源于交感神经系统，其特点是由复杂的遗传改变（包括MYCN基因扩增、染色体1p缺失以及发育信号通路的异常激活）驱动的高度异质性[1]、[2]、[3]。尽管结合化疗、放疗和手术的多模式治疗策略取得了显著进展，但高危患者的长期生存率仍低于30%，这凸显了阐明肿瘤进展和治疗耐药性分子机制的迫切需求[2]、[4]、[5]。在生物研究中，建立可靠的体外模型对于研究这些细胞级联反应至关重要。人神经母细胞瘤细胞系，尤其是SH-SY5Y细胞系，由于其神经元样特性和一致的生长特性，被广泛用于神经母细胞瘤研究的体外模型。

骨髓（BM）是神经母细胞瘤最常见的转移部位，约50%的患者在诊断时即存在骨髓受累[6]。这一微环境通过恶性细胞与驻留基质和免疫群体之间的复杂相互作用，为肿瘤细胞的存活、增殖和免疫逃逸提供了专门的生态位[7]、[8]。单细胞转录组分析揭示了转移性骨髓中免疫细胞群体的深刻重塑，包括肿瘤相关中性粒细胞、M2极化巨噬细胞和耗竭T细胞的富集，同时伴随细胞毒性淋巴细胞的耗竭[9]、[10]。这些细胞学改变有助于建立免疫抑制性微环境，有效阻碍了抗肿瘤免疫反应[3]。

肿瘤免疫微环境（TIME）在决定疾病进展和治疗反应中起着关键作用[4]。TIME由多种免疫细胞群体组成，包括T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞和巨噬细胞，每个群体都参与抗肿瘤免疫或免疫抑制[11]。在高危神经母细胞瘤中，TIME通常表现为深刻的免疫抑制，效应T细胞浸润减少，调节性T细胞和髓源性抑制细胞群体扩增[3]。TIME中的细胞-细胞通讯越来越多地被认为是转移进展和治疗耐药性的关键调节因子[12]。CellChat等计算工具使得能够系统分析不同细胞群体之间的配体-受体相互作用，揭示了调控免疫细胞招募、激活和功能复杂信号网络[13]。因此，理解这些通讯网络对于识别新的治疗靶点和开发重编程免疫抑制性TIME的策略至关重要[1]、[13]。

免疫信号激酶，特别是Src家族激酶（SFKs），是正常免疫功能和癌症发生中的关键调控层[14]。SFK家族在哺乳动物中包括八个成员：SRC、FYN、YES、LCK、LYN、HCK、FGR和BLK，每个成员具有不同的表达模式和生物学功能[15]。SFKs将信号从多种表面受体（包括T细胞受体（TCRs）、B细胞受体（BCRs）和细胞因子受体）进行传导，从而协调免疫反应[16]。除了其在免疫信号传导中的经典作用外，SFKs的致癌激活促进肿瘤细胞增殖、存活、迁移和侵袭，同时调节肿瘤免疫微环境[14]、[17]。SFK抑制剂（如达沙替尼）在临床前模型中展现出抗肿瘤活性；然而，临床转化面临与毒性和耐药性相关的挑战[17]、[18]。

在SFK成员中，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶占据独特地位。LCK是一种56 kDa的非受体酪氨酸激酶，主要表达于T淋巴细胞中，作为T细胞发育、激活和功能的主调节因子[19]。LCK通过锌介导的相互作用与CD4和CD8共受体的胞质尾部组成性结合，使其定位于TCR复合物附近[20]。当TCR与肽-MHC复合物结合后，LCK通过抑制性Tyr505残基的去磷酸化和激活性Tyr394残基的自磷酸化而被激活，随后磷酸化CD3ζ链上的免疫受体酪氨酸基序（ITAMs），为Syk家族激酶ZAP-70创建对接位点[16]、[21]。这启动了一个信号级联反应，最终导致T细胞激活、增殖和分化。此外，LCK参与BCR信号传导和IL-2/IL-7受体信号传导，促进T细胞稳态维持[19]、[22]。值得注意的是，新兴证据表明LCK并非仅在淋巴细胞中表达，也存在于某些实体肿瘤中，包括神经母细胞瘤，在其中积极参与调控细胞增殖、存活和迁移[19]、[23]。

多条证据共同指向LCK参与神经母细胞瘤的发生发展。首先，LCK基因定位于染色体1p32-p34，该区域在侵袭性神经母细胞瘤中经常发生缺失[24]、[25]。染色体1p缺失发生在约70%的晚期肿瘤中，并作为预后不良的独立预测因子[26]。这种共定位强化了LCK可能在肿瘤发生中发挥作用的假说。其次，LCK已被证明可以磷酸化FOXP3，从而调节MMP9表达和细胞侵袭[27]。在儿童脑肿瘤中，LCK抑制可敏化肿瘤细胞对常规治疗[28]。第三，LCK的免疫信号功能与神经母细胞瘤TIME直接相关，因为LCK对T细胞激活和细胞毒功能至关重要，影响着抗肿瘤免疫与免疫抑制之间的平衡[19]。第四，神经母细胞瘤骨髓转移的初步scRNA-seq分析已鉴定出不同细胞群体中LCK表达的异质性，转移性和非转移性样本之间存在显著差异，表明LCK可能作为免疫标志物和转移生态位功能异质性的贡献者[10]。

LCK在抗癌药物诱导凋亡中的作用尤为重要。基础性研究已表明，缺乏LCK的细胞几乎不表现出线粒体改变，并在多柔比星作用下无法发生凋亡，而表达LCK的细胞则能有效进入程序性细胞死亡通路[5]。LCK调控线粒体凋亡级联反应的早期阶段，包括线粒体膜电位破坏、细胞色素c释放和半胱天冬酶激活[29]。有趣的是，这一功能特异于LCK，不能由相关酪氨酸激酶Src补偿；此外，它与LCK的催化活性无关，可能通过非激酶机制介导[5]。另一方面，多柔比星作为神经母细胞瘤治疗的基石药物，已被证明可调节癌细胞中的microRNA表达谱[30]，而miR-27a已成为免疫信号通路的关键调节因子[31]。这提出了一个重要的问题：多柔比星是否可能通过miR-27a介导的调控影响LCK表达[31]、[32]、[33]。

淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）是一种Src家族激酶，其催化活性取决于由其N端叶和C端叶形成的高度保守的ATP结合裂缝[34]。结构和对接研究表明，铰链残基Met319为ATP竞争性配体提供主要的氢键锚定点，而Thr316充当守门残基并对抑制剂选择性和结合亲和力有重要贡献；其他重要的ATP位点残基包括Lys273、Glu288、Leu251、Ala271、Tyr318和Asp382[35]。达沙替尼结合LCk的ATP/铰链区域，并由由Thr316、Ile314、Met292、Glu288和Lys273组成的疏水口袋稳定，其中Thr316形成该口袋的入口；Thr316的突变会破坏达沙替尼在铰链区域的稳定结合。博舒替尼也靶向ATP结合区域，但其结合特征为较少的直接铰链氢键和涉及Glu314的水介导相互作用，表明ATP口袋周围的保守极性和疏水残基共同决定了抑制剂的识别[36]。此外，LCk包含一个位于变构螺旋附近的变构结合区域，已被II型肽模拟抑制剂利用；分子动力学分析进一步鉴定出Tyr318、Met319、Arg366、Trp424、Ser425、Ile370和Leu371为具有高动态中心性的残基，表明它们参与在调控元件和催化核心之间传递构象信息[37]、[38]。因此，准确考虑ATP位点残基（特别是Met319、Thr316、Lys273、Glu288和Asp382）和变构通讯残基对于解释对接构象和论证LCk抑制剂（如达沙替尼和博舒替尼）的活性至关重要[37]。

此外，CellChat分析神经母细胞瘤样本已揭示，与对照组相比，转移性样本中T细胞与造血祖细胞之间的通讯模式发生了显著改变，与LCK相关的相互作用权重在侵袭性样本中增加[10]。这一发现将LCK定位超越细胞内信号分子，突出了其作为肿瘤微环境中复杂相互作用调节因子的角色。

尽管LCK在化疗诱导凋亡中的作用已相对明确，但关于其精确作用机制的基本问题仍未得到解答。一方面，尚不清楚多柔比星是否能够直接物理结合LCK蛋白；另一方面，如果确认了这种直接相互作用，则问题在于这种结合是否可以作为LCK在凋亡中作用的替代机制，独立于其激酶活性。

因此，本研究设计了三个主要目标：第一，查明LCK在神经母细胞瘤患者骨髓三种不同群体（转移性、非转移性和对照组）中的表达模式；然后，调查多柔比星处理前后神经母细胞瘤细胞中LCK基因表达的变化，以确定该药物对此激酶转录水平的影响；第三，检查LCK蛋白与多柔比星之间的分子相互作用（对接），确认或否定这两分子之间直接物理结合的可能性；并鉴定潜在结合位点的关键氨基酸，为设计新型治疗药物或优化现有药物提供结构见解。

实现这些目标可能加深我们对药物精确作用机制的理解，并阐明LCK在治疗反应中的功能角色。需要注意的是，LCK在神经母细胞瘤中的角色尚未被完全理解。尽管LCK在某些细胞背景下是多柔比星诱导凋亡所必需的，但其染色体定位在1p32-35——一个在侵袭性神经母细胞瘤中经常发生缺失的区域——暗示了一种潜在复杂且可能具有情境依赖性的角色。因此，本研究旨在检查LCK表达变化和潜在相互作用，而非建立明确的治疗策略。这些发现仍可能为未来针对神经母细胞瘤LCK导向方法的研究提供基础。

## 部分摘要

### 单细胞RNA测序数据分析

本研究旨在鉴定LCK基因在神经母细胞瘤骨髓细胞类型中的表达水平。使用R包"Seurat"（v5.3.0）进行数据处理和可视化[39]。为此，整合了来自GSE216155的对照样本（无骨髓浸润）的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据，以及来自GSE220946的非转移性和转移性样本。经过质量控制后，保留检测基因数在200–5000之间、低于10%的细胞……

### 单细胞RNA测序分析

在归一化和整合GSE216155数据集的五个对照样本以及GSE220946数据集的八个非转移性和七个转移性样本后，使用Seurat软件进行细胞聚类。分析发现细胞可分为44个不同的簇。使用SingleR包进一步注释这些簇，鉴定出八种主要细胞类型，包括B淋巴细胞、CD4阳性α-β T细胞、CD8阳性……

## 讨论

本研究旨在调查酪氨酸激酶LCK在神经母细胞瘤肿瘤微环境中的关键角色，特别是针对化疗药物多柔比星的反应。整合细胞-细胞通讯生物信息学分析、基因表达谱和分子对接的多层面方法，为这个分子在该儿童恶性肿瘤发病和治疗中的意义提供了新的见解。我们的发现表明……

### CRediT作者贡献声明

Ayda Tafazoli：撰写—初稿、调查、形式分析。Nahid Askari：撰写—审阅与编辑、监督、数据管理、概念化。Saeideh Jafarinejad Farsangi：撰写—审阅与编辑、监督……

### 数据可用性

本研究分析的单细胞RNA测序数据集来自基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE216155和GSE220946。本研究产生或分析的所有其他数据，包括qRT-PCR数据和引物序列，均已包含在本已发表文章及其补充信息文件中。

### 伦理批准

本项目经伊朗克尔曼高等技术研究生院伦理委员会批准，伦理批准编号为"03.91064"。

### 资金支持

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何专门资金资助。

### 利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

### 致谢

作者衷心感谢……

感谢 Morteza Hadizadeh 在数据分析方面提供的宝贵帮助，同时也感谢高等技术大学为这项研究提供了必要的设施和funding。

作者：Ayda Tafazoli | Nahid Askari | Saeideh Jafarinejad Farsangi