遗传与药理学促进星形胶质细胞活性改善小鼠脊髓损伤后运动功能：SOCS3/STAT3通路与Dyclonine高通量伤口愈合测定

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Promoting astrocytic activity genetically and pharmacologically increases locomotor function after spinal cord injury in mice

　　

本研究关注小鼠脊髓损伤（SCI）后通过遗传和药理学方式促进星形胶质细胞活性以增加运动功能。细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）在星形胶质细胞中缺失可促进伤口愈合，并在成年小鼠SCI后诱导转棒（rotarod）运动功能；研究人员开发了一种新型高通量划痕实验工具，较既往方法提高了均一性；Dyclonine给药可促进转棒上的运动恢复。

论文主体解读

脊髓损伤（SCI）是卒中之后第二常见瘫痪原因，美国每年约18,421例新发，尚无FDA批准促进神经恢复的治疗；SCI发病年龄约44岁且老龄人群增加，治疗开发需考虑年龄因素。损伤后反应性星形胶质增生（reactive astrogliosis）和胶质边界（glial border）形成是中枢神经系统（CNS）创伤后级联事件；星形胶质细胞增殖迁移围绕病灶，产生软骨素硫酸蛋白聚糖（CSPGs）等抑制轴突再生。胶质瘢痕（glial scar）作用具双重性：胶质边界可限制炎症和病灶扩展、减少继发性损伤并提供桥接，削弱边界则加重缺损；因此急性期增强星形胶质细胞边界/伤口愈合有治疗潜力。问题在于能否通过信号转导与转录激活因子3（STAT3）活化（删除其负调控因子SOCS3）增强愈合和恢复，并建立高通量筛选平台。

Arthur Sefiani、Theresa C. Sutherland、Darijana Horvat和Cédric G. Geoffroy开展研究：通过星形胶质细胞特异性AAV-Cre删除SOCS3，评估小鼠SCI后运动恢复和病灶；建立新型游离浮动384孔划痕工具及成年原代皮质星形胶质细胞伤口愈合测定，筛选FDA批准药物；在T8压迫/挫伤SCI模型验证Dyclonine。结论是：SOCS3缺失促进体外伤口愈合、呈减小体内病灶趋势并改善转棒运动；新测定均一性优于固定尖端；Dyclonine剂量依赖性减小体外伤口，伤后4 h给药7周改善转棒恢复，病灶非显著下降。意义在于支持“调节而非消融”反应性星形胶质细胞，并提供高通量筛选平台和候选药物。

关键技术包括：以星形胶质细胞特异性GfaABC1D启动子驱动Cre的AAV载体，在SOCS3^fl/fl;Ai14^fl/fl小鼠脊髓局部实现SOCS3缺失；建立基于CyBio Well vario 384/60 μL移液头的新型游离浮动划痕工具，进行384孔高通量伤口愈合测定；使用成年小鼠原代皮质星形胶质细胞（12周龄雄性Ai14^fl/fl与SOCS3^fl/fl;Ai14^fl/fl小鼠，6–8周龄C57Bl/6NJ雌雄小鼠）及4月龄雄性C57Bl/6NJ小鼠T8压迫/挫伤SCI模型；行为学采用Basso小鼠量表（BMS）和转棒，组织学采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）/DAPI定量病灶；Dyclonine经腹腔给药。动物实验经Texas A&M University IACUC 2018-0324批准。

结果：1. 脊髓星形胶质细胞SOCS3体内缺失改善胸段压迫/挫伤SCI后功能恢复。通过AAV-GfaABC1D-Cre或载体注射SOCS3^fl/fl;Ai14^fl/fl小鼠T8，7天后中度SCI，进行BMS和转棒；BMS无显著差异，转棒跌落潜伏期和转速在伤后28天显著增加（P<0.05），提示伤前调节SOCS3/STAT3可增强恢复。2. 脊髓星形胶质细胞SOCS3缺失减小体内SCI病灶。通过同前严重SCI后28天GFAP/DAPI测病灶；AAV诱导SOCS3敲除组病灶面积呈下降趋势（P=0.068），提示激活星形胶质增生可减小病灶并促进恢复。3. 原代皮质星形胶质细胞SOCS3缺失增加体外伤口愈合潜力。通过AAV-Cre转导野生型与SOCS3^fl/fl;Ai14^fl/fl皮质星形胶质细胞，人工划痕48 h后Phalloidin测面积；SOCS3缺失显著减少伤口面积（P<0.05），重现体内效应并推动建立高通量筛选。4. 游离浮动设计产生一致的人工伤口。通过比较游离浮动与固定尖端384孔划痕；固定法伤口大小范围增加89%、标准差增加74%，均值无差异（p=0.8002），F检验显示孔间变异显著降低（p<0.0001）。5. 培养基体积影响星形胶质细胞的增殖和/或迁移。通过5000细胞/孔、10% FBS、不同体积、36 h、雌雄细胞；伤口随体积增加而显著增大（p<0.0001），雌雄无显著差异，选20 μL。6. 最佳细胞接种密度。通过不同密度、10% FBS、20 μL、36 h；接种数显著影响伤口（p<0.0001），至少5000细胞/孔可避免密度影响，故选5000/孔。7. 最佳胎牛血清（FBS）浓度。通过不同FBS浓度、36 h；FBS增加呈剂量依赖性减小伤口（p<0.0001），选10% FBS。8. 二甲基亚砜（DMSO）耐受性。通过不同DMSO浓度、36 h；DMSO浓度与伤口大小显著正相关（p<0.0001），≤0.4%无差异，可用至0.4%但应最小化并全孔一致。9. Dyclonine减小体外损伤并促进运动功能恢复。通过L形划痕、不同Dyclonine浓度、雌雄皮质星形胶质细胞；Dyclonine剂量依赖性减小伤口（雄性p<0.0001，雌性p=0.0035），性别一致。通过4月龄雄性C57Bl/6NJ小鼠T8 50 kDyn、2 s SCI，伤后4 h开始Dyclonine 5 mg/kg腹腔注射、每周3次7周；BMS无影响，转棒跌落潜伏期显著增加；7周组织学病灶平均减少30%、变异降低40%，但非显著。提示该测定可识别促恢复化合物。

讨论指出，星形胶质细胞反应具动态、年龄和情境依赖性；急性/亚急性期胶质边界通过包裹炎症病灶和纤维性瘢痕限制继发性损伤，故应调节而非消融星形胶质细胞反应。研究推进概念转变、建立可扩展筛选平台、识别有转化潜力药物。STAT3是反应性星形胶质增生重要转录因子；本研究首次在成年小鼠伤前1周通过AAV星形胶质细胞特异性靶向SOCS3/STAT3，证明可减小体内外病灶并改善转棒功能。但伤前基因删除非临床相关，持续STAT3活化长期可能不利，短暂剂量可控药物调节更合适。新划痕工具成本低、均一性高、模块化，可用成年皮质星形胶质细胞并纳入性别和年龄变量；因成年小鼠脊髓胶质细胞量少且白质比例高，未用于高通量筛选；FBS为维持成年星形胶质细胞所需；该测定不能区分迁移与增殖，但48 h内DAPI核数无显著变化提示迁移为主。Dyclonine为FDA批准药物，讨论提出其可能通过核因子E2相关因子2（Nrf2）/线粒体功能等发挥作用，并需验证与STAT3通路关系；其仅改善转棒而未改变BMS，需进一步研究。

研究结论翻译：此前，通过增加成年小鼠星形胶质细胞活性促进伤口愈合在临床前SCI模型中的益处尚不清楚。本研究证明，SCI后急性期通过遗传和药理学增加星形胶质细胞活性促进伤口愈合，可增强转棒测试中的运动功能。遗传操作显示，原代皮质星形胶质细胞中SOCS3缺失增加体外伤口愈合潜力，脊髓中缺失改善运动恢复。因此，有必要识别能复制该活性的药物以形成更临床相关的治疗策略；这需要筛选大型药物库，而现有技术无法实现。既往伤口愈合测定受限于低通量或昂贵且已停产的划痕工具，且可能不适合培养板自然差异。本研究建立使用新型工具的高通量筛选方案，较既往工具提高均一性，并兼容原代成年皮质胶质细胞，提高结果与成人神经系统疾病的相关性。研究人员成功用该测定识别FDA批准药物Dyclonine，即使伤后4小时给药仍促进运动功能，代表临床相关时间窗。该测定可帮助已批准药物重定位和新药识别。总之，这一新方法有望通过提供更临床相关的体外伤口闭合数据改善神经创伤药物发现过程。