破坏主要的GTP水解机制会导致HAS-GTP酶（Era和FeoB）中出现替代催化机制

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Disrupting primary GTP hydrolysis mechanisms leads to the emergence of alternative catalytic mechanisms in HAS-GTPases, Era and FeoB.

　　

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  FeoB和Era催化突变体的晶体结构揭示了持续GTP水解的结构基础。
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  活性位点水分子经历了广泛的重新排列，以建立替代的水链介导催化通路。
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  结构可塑性使得当主要水解机制被破坏时能够实现催化的重新布线。
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  这些发现建立了HAS-GTPases替代催化的机制框架，并提示长水链介导的水解可能是慢GTPases的一个普遍特征。

引言

G蛋白或GTP酶是GTP水解酶，构成了一类重要的调控蛋白，调节细胞生长、信号传导、蛋白质合成和分子运输等关键细胞过程^{1, 2, 3}。GTP向GDP和无机磷酸的酶促水解通常与"开关"区域（开关I和开关II）发生显著的结构重排相偶联，这些区域与下游效应分子形成界面^{3, 4}。GTP酶在GTP存在时达到活性"ON"状态，并与其它效应结构域/蛋白质相互作用。GTP水解将其切换为GDP结合的"OFF"状态，从而消除上述相互作用。由于它们有效地将核苷酸状态的变化传达给激活/失活的生化途径，GTP酶被称为"生物开关"^{2, 5}。

GTP水解对于生物开关的及时失活至关重要，并由GTPase Activating Proteins（GAP，GTP酶激活蛋白）严格调控。GAPs增强本征缓慢的水解速率以控制活性状态的持续时间。因此，消除GTP水解的突变使下游信号传导处于永久"ON"状态^{6, 7}。GTP水解反应涉及活化的水分子对γ-磷酸的亲核攻击，导致连接GTP的β和γ磷酸之间的磷酸酐键断裂^{2, 4}。Ras-RasGAP复合物的过渡态结构（结合过渡态类似物GDP.AlF₃）揭示，来自开关II区域的催化谷氨酰胺Gln61（称为Gln^cat）将攻击水分子定位到更靠近GTP的γ-磷酸处以完成水解⁸。计算和实验研究进一步确立Ras利用"Substrate Assisted Catalytic（SAC，底物辅助催化）机制"进行GTP水解，其中GTP的末端磷酸作为通用碱来活化亲核水分子^{9, 10, 11, 12, 13, 14, 15}。Gln^cat促进亲核水的活化，但其本身不足以启动水解。它由RasGAP外部提供的精氨酸残基（Arg^GAP）定向为催化活性构象^{8, 16}。Arg^GAP还中和带负电的过渡态并加速GTP水解。值得注意的是，据报道这种催化排列有许多变体，包括阳离子（Na⁺或K⁺）承担Arg^GAP的角色^{17, 18, 19}，以及组氨酸（His）取代Gln^cat，如翻译GTP酶EF-Tu^{20, 21, 22}所示。我们后来提供了一个统一多种GTP水解机制的结构基础²³。尽管存在这些变异，经典GTP酶仍使用SAC机制进行GTP水解。Gln^cat（或相应的催化残基）始终从开关II区域保守的DxxG基序相邻的独特位置提供。

有趣的是，存在一类功能GTP酶，它们在Gln^cat位置以疏水取代。这些Hydrophobic Amino-acid Substituted（HAS，疏水氨基酸取代）GTP酶尽管缺乏Gln^cat，仍能有效催化GTP水解²⁴。被取代的疏水氨基酸远离活性位点的带电环境，从而提供了从不同方向供应催化残基的可能性。少数HAS-GTPases（atlastin、MnmE和dynamin）的可用过渡态结构说明了催化残基的不同空间起源^{19, 25, 26}。与Ras的Gln^cat直接活化攻击水分子不同，HAS-GTPases利用桥接水介导的相互作用来活化类似水分子（图S1）。深入调查仍在揭示HAS-GTPases所采用的多种催化机制。

FeoB是一种独特的多结构域HAS-GTP酶，促进Fe²⁺跨越细菌内膜的运输^{27, 28}。存在于N端胞质部分（NFeoB）的G结构域通过C端跨膜结构域调节Fe²⁺运输^{29, 30}。对胞质结构域功能机制基础的深入了解来自于对Streptococcus thermophilus NFeoB（StNFeoB）的详细结构研究^{31, 32, 33, 34}。然而，由于无法推断催化残基，这些研究无法阐明水解机制。一个谷氨酸对——Glu66和Glu67——高度保守，并且被发现参与γ磷酸周围一套复杂的水介导相互作用。在E. coli FeoB中与Glu66等价的残基突变破坏了铁的运输——即FeoB的生理功能²⁹。综合起来，这些观察加强了这对谷氨酸具有催化作用的可能性。然而，单个谷氨酸突变体的生化研究揭示了一个令人惊讶的不同发现。这些突变体并未完全消除GTP水解，而是仅降低了水解速率（约60%）^{32, 35}。由于这与催化残基突变体的预期不符，对其研究使我们发现FeoB在缺乏这些谷氨酸时可能采用其他有趣的催化替代方案。在本研究中，我们试图明确理解谷氨酸对在GTP水解中的作用，并探索其缺失时的催化替代方案。为此，我们确定了StNFeoB突变体的过渡态结构，这些结构得到了我们先前报道的量子力学/分子力学（QM/MM）混合模拟的支持³⁵。这使得我们能够阐明每个谷氨酸在GTP水解中的作用。这些研究共同说明了这对谷氨酸的催化重要性，并突出了StNFeoB突变体所表现出的可塑性。

我们还研究了另一种HAS-GTP酶Era，它在30S亚基组装中发挥作用^{36, 37, 38}。迄今为止，Era所采用的GTP水解机制仍不为人知。在此，我们也呈现了Aquifex aeolicus Era（AaEra）的结构和生化研究，并提出了一种可能的水解机制：对StNFeoB和AaEra催化机制的比较使我们能够推断HAS-GTPases中GTP水解的一般原则。与StNFeoB类似，在AaEra中，我们也观察到活性位点残基的突变并不消除GTP酶活性，这表明存在GTP水解的替代机制。这些尝试揭示了HAS-GTPases催化机制的迷人方面，并提出了由结构可塑性驱动的新的替代方案，表明这些系统具有内在的稳健性。

章节摘要

Glu66和Glu67在FeoB中发挥GTP水解的催化作用

对StNFeoB的QM/MM模拟确定了E66和E67作为质子受体来活化亲核试剂³⁵。有趣的是，突变其中任何一个仅降低GTP水解约60%，但并未完全消除它。我们试图通过在过渡态中确定它们的结构来理解这一迷人现象。StNFeoB E67A在过渡态模拟物GDP.AlF₄^-存在下结晶，以PEG 6000作为沉淀剂。晶体衍射分辨率

总结与展望

HAS-GTPases在对应于Ras的催化Gln（Gln^cat）位置含有一个疏水残基，即紧跟在开关II保守基序DxxG之后，在Ras和Ras样GTP酶中该残基直接活化攻击水分子。催化Gln/His被无法活化水分子的疏水残基取代这一事实，需要引入替代机制来进行催化。在HAS-GTPases中，被取代的疏水残基采用

StNFeoB表达质粒

编码NFeoB结构域（StNFeoB）的DNA（对应残基1-270）以Streptococcus thermophilus（ATCC）的基因组DNA为模板进行扩增，并克隆到经修饰的pGEX表达载体中，该载体携带TEV蛋白酶切割位点，用于从融合蛋白中去除N端GST标签。所有StNFeoB突变体均通过重叠PCR方法构建，以pGEX-StNFeoB WT载体为模板。引物（表S3）用于特定

CRediT作者贡献声明

Ashok Kumar：资源。Balaji Prakash：撰写——审阅与编辑，监督，资源，资金获取，概念构思。Sahil Batra：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，调查，概念构思

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢印度理工学院坎普尔分校（IIT Kanpur）的Neha Vithani博士和Nisanth Nair教授提供的科学建议以及分享模拟快照以准备插图。我们感谢美国国立癌症研究所（National Cancer Institute）NIH的David Waugh教授慷慨馈赠Aquifex Era表达构建体。我们感谢新德里国家免疫学研究所和班加罗尔国家生物科学中心的X射线晶体学设施进行数据收集。我们感谢

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