《Veterinary Sciences》：Comparative Hemagglutinin Phylogeny and Whole-Genome Molecular Characterization of Avian Influenza Viruses Circulating in Romania with Markers of Pathogenicity and Host Adaptation
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摘要专业翻译
属于分支2.3.4.4b的禽流感A(H5)病毒持续在欧洲野生和家养鸟类种群中传播，对禽类和公共卫生构成持续威胁。罗马尼亚位于主要候鸟迁徙路线上的流行病学重要位置，是病毒反复传入的焦点区域。本研究对2024–2026年间在罗马尼亚检测到的H5禽流感
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属于分支2.3.4.4b的禽流感A(H5)病毒持续在欧洲野生和家养鸟类种群中传播，对禽类和公共卫生构成持续威胁。罗马尼亚位于主要候鸟迁徙路线上的流行病学重要位置，是病毒反复传入的焦点区域。本研究对2024–2026年间在罗马尼亚检测到的H5禽流感病毒的遗传多样性和分子标记进行了表征，并将其置于更广泛的欧洲进化背景下。研究人员筛选了2024年1月3日至2026年3月24日期间收集的31株罗马尼亚H5病毒的完整八片段基因组（eight-segment genomes）的分子标记，并使用最大似然系统发育分析（maximum-likelihood phylogenetics）对其血凝素（hemagglutinin, HA）基因进行分析，同时与来自匈牙利、保加利亚、塞尔维亚、乌克兰、意大利和德国的618条同期血凝素序列进行比较。血凝素基因的系统发育分析将罗马尼亚病毒置于欧洲分支2.3.4.4b多样性范围内，与邻国病毒形成强支持聚类。所有31株病毒均具有多碱性血凝素切割位点基序PLREKRRKR/GLFG，与高致病性分子特征一致。在一株病毒（3.2%）中检测到PB2 E627K替换；该病毒中未检测到其他所检查的哺乳动物适应标记，且D701N、T271A和Q591R/K在整个数据集中均不存在。对全部八个基因组片段的分子筛选显示，在选定位置上存在有限的变异，氨基酸背景总体保守。这些结果有助于了解东南欧高致病性禽流感H5的分子流行病学，并支持持续开展全基因组监测。
论文解读
一、研究背景与研究目的
禽流感病毒（avian influenza viruses, AIVs）是对动物健康、家禽生产、野生动物保护以及在某些情况下公共卫生构成重大且持续演变的威胁。甲型流感病毒拥有分节段的负链RNA基因组，包含八个基因片段。由于病毒依赖RNA的RNA聚合酶缺乏校对功能，复制过程中突变不断累积，同时分节段的基因组结构允许两种或以上病毒共感染同一宿主时发生基因重配（genetic reassortment）。这两种机制共同促成了禽流感病毒广泛的遗传多样性，并可能导致病毒致病性、宿主范围、传播性以及对新宿主物种适应性的变化。
近年来，属于A(H5)鹅/广东谱系的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI）病毒经历了广泛的多样化和地理扩张，其中分支2.3.4.4b病毒已在众多欧洲国家占据主导地位，并在广泛的野生和家养禽类宿主中被检测到。野生鸟类，特别是迁徙性水禽，在高致病性禽流感病毒的长距离传播中发挥重要作用，而病毒反复传入家禽种群则为局部传播和进一步病毒进化创造了机会。
罗马尼亚位于欧洲主要鸟类迁徙路线上具有流行病学重要性的地理位置，因此通过野生鸟类的移动面临禽流感病毒反复传入的风险。对罗马尼亚病毒循环的解读需要考虑邻国及其他欧洲地区检测到的病毒。将罗马尼亚禽流感病毒序列与邻国及其他流行病学相关欧洲国家的当代病毒进行比较分析，对于阐明其区域进化关系至关重要，而对罗马尼亚病毒的全基因组表征则可提供多个病毒基因片段分子变异方面的额外信息。
本研究旨在表征2024–2026年间在罗马尼亚循环的禽流感病毒的遗传多样性，并通过与邻国及流行病学相关国家的当代病毒比较，将其置于更广泛的欧洲进化背景下。此外，研究人员对病毒蛋白进行了与致病性和宿主适应相关的分子标记筛选，通过整合比较性HA系统发育分析、宿主信息和罗马尼亚病毒全基因组的分子表征，为罗马尼亚禽流感病毒的进化和循环提供最新的分子视角，并支持与禽流感防控相关的基因组监测活动。
二、研究设计与关键方法
本研究使用了2024–2026年研究期间由罗马尼亚项目团队生成并存入GISAID EpiFlu?数据库的禽流感病毒基因组数据。比较数据集于2026年8月17日从GISAID EpiFlu?数据库检索，筛选条件为：A型流感；采集国家为匈牙利、保加利亚、塞尔维亚、乌克兰、意大利或德国；采集日期在研究期间内（2024年1月1日至2026年6月30日）。检索时不设宿主、亚型或分支过滤器，随后在数据集整理阶段限制为H5亚型和分支2.3.4.4b。最终系统发育数据集包含649条血凝素序列：31株罗马尼亚病毒和618株欧洲病毒（意大利270株、德国284株、保加利亚35株、匈牙利21株、乌克兰7株、塞尔维亚1株）。
血凝素核苷酸序列的多序列比对使用MAFFT version 7通过MAFFT网络服务器进行，采用FFT-NS-2渐进比对策略。最终比对包含649条序列，覆盖1784个比对核苷酸位点。最大似然系统发育树使用IQ-TREE 3（版本3.1.3）推断，最佳拟合核苷酸替换模型由ModelFinder在贝叶斯信息准则下选择，确定为GTR + F + I + R3。分支支持度通过1000次超快自举重复（UFBoot）和SH-aLRT检验评估，节点在UFBoot ≥ 95%且SH-aLRT ≥ 80%时视为强支持。此外，研究人员还对31株罗马尼亚病毒的八个基因组片段分别推断最大似然系统发育树，使用各片段特异性的当代分支2.3.4.4b比较面板，通过比较病毒在八个独立推断的片段系统发育树中的相对位置来评估重配事件。
分子标记分析方面，PB2蛋白在158、271、559、588、590、591、627、661、683、684、701和702位点进行筛选；PB1蛋白在13、207、336、375、473、598、622和678位点；PA蛋白在36、37、55、65、100、224、268、356、383、409、515、550、552和615位点。氨基酸差异通过与固定参考序列A/American Wigeon/South Carolina/USDA-000345-001/2021（H5N1，分支2.3.4.4b；GISAID EPI_ISL_18133029）直接比较确定。神经氨酸酶亚型使用NCBI BLASTn网络服务确认。此外还检查了HA 222和224位点（H3等效226和228位点，与受体结合特异性相关）、NA 275位点（H275Y）和NA茎部区域（第49–68位，分别与奥司他韦耐药性和禽类适应相关）、M2蛋白26、27、30、31和34位点（与金刚烷胺耐药性相关）、NS1蛋白长度和C端PDZ结合基序、NS1 92位点（D92E）、PB1-F2长度和66位点（N66S）以及PA-X截断状态。
三、主要研究结果
3.1 罗马尼亚禽流感病毒数据集特征
罗马尼亚数据集包含2024年至2026年间收集的31株独特禽流感病毒，共248条病毒基因片段序列。其中18株（58.1%）于2024年收集，6株（19.4%）于2025年收集，7株（22.6%）于2026年收集。病毒来源于野生和家养鸟类，涵盖天鹅、鸥、鹳、鹅、鸡和火鸡等多种禽类宿主。所有31株罗马尼亚病毒均被分配至分支2.3.4.4b，且均为H5N1亚型，亚型分配通过BLASTn分析完整神经氨酸酶编码序列确认。所有31株罗马尼亚病毒均具有完整的八片段基因组数据。
3.2 与欧洲禽流感病毒的比较分析
比较数据集共包含来自六个选定欧洲国家的696株禽流感分离株：匈牙利23株、保加利亚37株、塞尔维亚1株、乌克兰20株、意大利301株、德国314株。连同31株罗马尼亚病毒，完整数据集包含727株独特禽流感分离株，由5663条基因片段序列记录代表。各国时间代表性存在差异，塞尔维亚仅以2024年9月收集的单株分离株为代表。
3.3 罗马尼亚H5病毒的系统发育关系
血凝素基因最大似然系统发育分析将罗马尼亚H5病毒置于分支2.3.4.4b内，与比较数据集中的当代欧洲病毒共同分布。罗马尼亚病毒分布在欧洲分支2.3.4.4b多样性的多个分支上，而非形成单一国家特异性谱系。多个罗马尼亚病毒出现在包含其他欧洲国家病毒的混合系统发育群中。一个包含126条序列的强支持群包括6株罗马尼亚病毒，与意大利、德国、匈牙利、保加利亚、乌克兰和塞尔维亚的病毒共同聚类。另一个包含35条序列的强支持群含1株罗马尼亚病毒及意大利、保加利亚和德国的病毒。2025年罗马尼亚鸥病毒与意大利赤颈鸭病毒紧密聚类，罗马尼亚产蛋母鸡病毒与德国病毒密切相关。罗马尼亚病毒之间也观察到强支持关系，包括2025年鸡和鹅病毒形成高支持配对，2024年家鹅和产蛋母鸡病毒聚类，以及两只大天鹅病毒形成强支持配对。2026年2月收集的罗马尼亚鹅和火鸡病毒形成强支持配对，而其他2026年收集的罗马尼亚病毒在系统发育上与2025–2026年德国、意大利和乌克兰检测到的代表性病毒接近。
3.4 逐片段系统发育分析与重配评估
对31株罗马尼亚病毒全部八个基因组片段推断最大似然系统发育树。在八个片段中的六个——PB1、PA、HA、NA、M和NS——2025年10月以后收集的八株病毒形成单一强支持进化枝。在PB2和NP中该组不形成单系群：其中三株病毒——A/whooper-swan/Romania/10121-23-01-2026_26VIR2682-2/2026、A/turkey/Romania/10384-12-02-2026_26VIR2682-6/2026和A/goose/Romania/10385-12-02-2026_26VIR2682-7/2026——在两个片段中均形成独立强支持群，而其余五株形成第二个强支持群。在PB2中，这三株病毒与2025年3月收集的罗马尼亚鸥病毒聚类。片段间强烈的系统发育不一致性与重配事件一致：这三株病毒携带的PB2和NP片段与其他五株病毒在共享聚类中分离。携带PB2 E627K的病毒A/hens/Romania/10849_24VIR4529-4/2024在PB2比较面板中位于包含2023–2024年罗马尼亚、克罗地亚、摩尔多瓦共和国、斯洛伐克和意大利检测到的病毒的支持进化枝内。2024年1月至2025年3月间收集的23株病毒在任何片段中均不形成单系群。
3.5 聚合酶复合物的遗传分析
PB2蛋白在627位点的E627K替换仅在31株病毒中的1株（A/hens/Romania/10849_24VIR4529-4/2024；3.2%）中鉴定到，该病毒采集自家禽。该病毒同时保留禽类相关残基T271、G590、Q591和D701。所有罗马尼亚病毒均保留701D，未检测到D701N。所有31株病毒均保留T271、G590和Q591，而588位点存在变异：27株编码588A，2株编码588V，2株编码588T。PB1蛋白在195、197、512、581和743位点存在氨基酸变异，而预定义标记位点13、207、336、375、473、598、622和678在所有31株病毒中均不变。PA蛋白的变异集中在66、104、226、696和707位点，预定义标记位点中65、100和356位点存在变异，其余标记位点不变。总体而言，聚合酶复合物分析显示氨基酸背景总体保守，在PB2、PB1和PA的选定位置存在离散变异。
3.6 血凝素的分子特征与氨基酸变异
所有31株罗马尼亚病毒均具有多碱性切割位点基序PLREKRRKR/GLFG，与高致病性H5禽流感病毒的分子特征一致。受体结合位点分析显示所有31株病毒均保留成熟H5 HA1编号中222位点的谷氨酰胺（Q222；等效于H3 226位点；HA0 238位点）和224位点的甘氨酸（G224；等效于H3 228位点；HA0 240位点），未检测到与哺乳动物受体结合特异性转变相关的替换（Q222L或G224S）。在HA胞外域中鉴定到六个潜在的N-连接糖基化序列（N-X-S/T），在所有31株病毒中保守，位于HA0编号的26、27、39、181、302和499位点。FluSurver分析显示A99D、P152S和S519N在所有31株病毒中均存在，T211A在19株中检测到，M120L在23株中检测到，V5I在11株中检测到。A226V和V526I在所有31株病毒中均存在。
3.7 NA、NP、M和NS蛋白的分子特征
NA蛋白中I106V和E395A在所有31株病毒中均存在，F465Y在11株中检测到，I94V和N329T各在8株中检测到。已确立的奥司他韦耐药标记位点119（E119）、223（I223）、275（H275）、293（R293）和295（N295）在所有31株病毒中均为野生型。NP蛋白变异有限，A234S在28株（90.3%）中检测到，N395T在27株（87.1%）中检测到。M1蛋白高度一致，L55M、R101K和V200A在所有31株病毒中均存在，A227T在1株中检测到，Q211H在来自同一养殖场的2株中检测到。M2蛋白在所有31株病毒中均为97个氨基酸，检查的位点均未检测到与参考序列的氨基酸差异。NS1蛋白中G28C、T56A、D152E和S165F在所有31株病毒中均存在，D171N在30株中检测到，V226I在23株中检测到。23株病毒（74.2%）编码全长230个氨基酸的NS1蛋白，携带ESEV（21/31，67.7%）或EPEV（2/31，6.5%）C端PDZ结合基序；8株病毒（25.8%）编码C端截短的217个氨基酸NS1蛋白，末端序列为LPPK，不构成功能性PDZ结合基序。最早检测到截短形式的是2025年10月22日收集的病毒，所有2026年收集的7株病毒均携带截短形式。D92E替换在所有31株病毒中均不存在。PB1-F2蛋白在所有31株病毒中预测为全长（90个氨基酸），N66S替换在2株野生鸟类病毒中检测到。PA-X在所有31株病毒中预测为全长（252个氨基酸），未鉴定到产生截短232个氨基酸变体的提前终止密码子。
四、讨论与结论
讨论部分总结
本研究的讨论部分强调了以下几个关键发现及其意义。罗马尼亚病毒不应被解读为孤立的国内病毒种群，HA系统发育分析将其置于当代欧洲分支2.3.4.4b病毒的更广泛遗传多样性中，与匈牙利、保加利亚、塞尔维亚、乌克兰、意大利和德国的病毒聚类，支持在解读国家监测数据时考虑区域病毒循环的重要性。罗马尼亚的地理位置沿重要候鸟迁徙路线，遗传相关的HA序列在罗马尼亚野生鸟类和家禽及欧洲其他地区病毒中的出现与涉及相互关联禽类种群的更广泛区域循环相容。然而，HA系统发育相似性本身无法确定特定传播路线或方向。
PB2 E627K在A/hens/Romania/10849_24VIR4529-4/2024中的鉴定值得特别关注。该替换与哺乳动物细胞环境中增强的聚合酶活性和哺乳动物动物模型中增加的毒力相关。该病毒在禽类相关残基D701、T271和Q591保留的同时出现E627K，表明E627K未与其他主要PB2哺乳动物适应标记共同出现，与E627K的孤立发生而非协调适应性背景一致。PB2 588位点的变异也值得关注：A588V在两株同日从同一家禽养殖场收集的病毒中检测到，代表单次检测而非独立出现；A588T在两株2026年初的大天鹅病毒中检测到。所有四株病毒的其余PB2筛选位点均保留禽类相关残基，未与E627K或其他哺乳动物适应标记组合。
数据集中最清晰的结构性时间发现涉及NS1蛋白。2024年1月至2025年3月间收集的所有23株罗马尼亚病毒编码全长230个氨基酸的NS1蛋白，具有完整的C端PDZ结合基序；而2025年10月以后收集的所有8株病毒编码C端截短的217个氨基酸蛋白。该分离是完全的，跨越野生鸟类和家禽，表明其与宿主无关。NS1的C端截短去除了PDZ结合基序，NS1通过该基序与参与细胞极性和凋亡信号传导的宿主PDZ结构域蛋白相互作用。
逐片段分析回答了仅凭血凝素系统发育无法回答的问题。2025年10月以后检测到的八株病毒中，三株携带的PB2和NP片段与其他五株在系统发育上不同，而在其余六个片段中共享相同谱系。在PB2中，这三株与2025年3月收集的罗马尼亚病毒聚类，表明重配体从已在区域循环的谱系中获得了这些片段。三株病毒于2026年1月至2月间在大天鹅、火鸡和家鹅中检测到，重配体在短期内同时出现在野生和家养宿主中。这一事件无法从血凝素系统发育中检测到。2025年10月以后收集的八株病毒也是编码截短217个氨基酸NS1蛋白的八株，并在八个片段中的六个形成强支持进化枝。因此截短不代表先前循环的罗马尼亚病毒群体中出现的突变，而是伴随基因组上不同的谱系传入。相比之下，2024年1月至2025年3月间收集的23株病毒在任何片段中均不形成单系群，与罗马尼亚反复独立传入而非单一谱系的持续本地循环一致。同日同养殖场检测到的两株病毒在八个片段中的七个一致，确认单次疫情中的检测可通过该方法与独立传入区分。
携带E627K的病毒在PB2系统发育中的位置值得注意：该病毒位于2023–2024年罗马尼亚、克罗地亚、摩尔多瓦、斯洛伐克和意大利检测到的病毒的支持进化枝内，与同期收集的其他罗马尼亚病毒分离，表明该替换发生在聚合酶碱性蛋白2片段来自不同区域谱系的病毒中。
研究结论翻译
2024年1月至2026年3月间在罗马尼亚检测到的H5N1病毒属于当代欧洲分支2.3.4.4b多样性的一部分，而非形成国家谱系，其分子特征在整个过程中保持以禽类相关为主。对全部八个基因组片段的分析表明，这一图景在基因组中并不均匀：分析鉴定了一次重配事件，并确定2025年10月以后检测到的病毒构成基因组上不同的谱系，而非早期循环病毒的本地进化。这两项发现均无法仅从血凝素基因中显现。因此，需要以全基因组而非仅基于血凝素的监测，并与区域基因组分析相结合，才能解读东南欧循环的病毒。
