《Veterinary Sciences》：Antimicrobial Resistance Profiles of Coagulase-Negative Staphylococci and MLST-Based Characterization of mecA-Positive Staphylococcus epidermidis Isolates from Companion Animals and Household-Associated Humans
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关于伴皮肤病变的伴侣动物及其主人来源凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci, CoNS）的抗菌药物耐药谱数据仍有限。本研究检查了这些分离株的耐药谱以及mecA阳性表皮葡萄球菌（Staphylococcus epid
关于伴皮肤病变的伴侣动物及其主人来源凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci, CoNS）的抗菌药物耐药谱数据仍有限。本研究检查了这些分离株的耐药谱以及mecA阳性表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的分子特征。自中国武汉160只犬和猫的皮肤病变拭子以及100名主人的鼻拭子中采集样本。在268株葡萄球菌分离株中，163株（60.8%）为CoNS，主要为S. epidermidis（n=90）和S. felis（n=22）。S. epidermidis对甲氧苄啶–磺胺甲噁唑（SXT，75.6%）、青霉素（PEN，72.2%）和红霉素（ERY，50.0%）显示高耐药率，39/90（43.3%）分离株被归类为多药耐药（multidrug-resistant, MDR）。S. epidermidis中最常检出的耐药基因为blaZ（90.0%）、ermC（32.2%）、mecA（n=24，26.7%）、tetK（25.6%）和aacA-aphD（24.4%）。S. felis同样对SXT（81.8%）、PEN（72.7%）和ERY（50.0%）显示最高耐药率，14/22（63.6%）分离株被归类为MDR；blaZ（81.8%）和ermC（54.6%）为最常检出的耐药基因。对24株mecA阳性S. epidermidis分离株进行多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）和葡萄球菌染色体mec盒（staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec）分型，发现12个序列型（sequence types, STs）和多样的SCCmec谱。最小生成树（minimum spanning tree, MST）分析显示，ST59在所分析的mecA阳性S. epidermidis序列型网络中与多个序列型相连。ST59和ST130均在人源和伴侣动物源分离株中检出。这些发现为人和伴侣动物来源分离株中耐药CoNS提供了基线流行病学信息，并支持将伴侣动物纳入One Health抗菌药物耐药监测。
研究背景：抗菌药物耐药是涉及人类、动物和环境的全球健康问题，耐药细菌和耐药基因可在这些场景中出现。伴侣动物是人–动物界面上重要但尚未充分探索的抗菌药物耐药储库。葡萄球菌常定植于人和动物皮肤及黏膜表面，并包含具有较大抗菌药物耐药潜力的机会致病菌。宠物与人密切接触可能使耐药葡萄球菌在宿主间传播，因此其在宠物和人群中的出现与One Health研究相关。CoNS是定植于人和动物皮肤及黏膜表面的共生菌；其历史上被视为低毒力机会致病菌，但S. epidermidis和S. haemolyticus等CoNS日益被认为是医疗相关血流感染和医疗器械相关感染的重要原因，尤其涉及血管内导管和植入假体等留置医疗器械。这种临床意义增长与留置医疗器械使用扩大、免疫受损患者增加及其形成生物膜的能力相关。此外，CoNS可作为抗菌药物耐药基因的储库，包括携带于SCCmec元件上的mecA，并可能促进葡萄球菌间甲氧西林耐药的传播。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）和耐甲氧西林假中间葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius, MRSP）已在伴侣动物中报道，且对这两个种的研究已发现来自宠物和人的遗传相关分离株。宠物及其主人中葡萄球菌研究主要集中于这两个种，而对CoNS了解较少。尽管已在健康和临床受累动物中研究CoNS，但关于客户拥有的伴皮肤病变宠物及其主人中CoNS耐药谱的数据仍有限；伴皮肤病的宠物中已报道耐甲氧西林CoNS。伴侣动物来源CoNS中，S. epidermidis和S. felis尤其受关注：S. epidermidis是人常见皮肤共生菌，因其潜在的人–动物交换而日益受关注；S. felis是猫相关种，尽管其新兴临床相关性受到关注，但其携带率、抗菌药物耐药谱和跨宿主传播潜力仍表征不足。这些知识空白凸显了系统研究人和伴侣动物来源CoNS的物种分布、抗菌药物耐药谱和分子特征的必要性。本研究调查了伴皮肤病病变伴侣动物及其主人来源CoNS分离株的物种分布、抗菌药物耐药谱和选定耐药基因存在情况；物种特异性分析聚焦于本研究中鉴定的两个主要CoNS种S. epidermidis和S. felis；对mecA阳性S. epidermidis分离株进一步进行MLST和SCCmec分型，以确定ST和SCCmec型多样性；随后构建基于MLST的最小生成树以可视化mecA阳性S. epidermidis分离株序列型之间的关系。本研究旨在One Health框架内提供人和伴侣动物来源耐药CoNS的基线信息。研究显示，CoNS占所有葡萄球菌分离株的60.8%（163/268），代表15个种，以S. epidermidis和S. felis为主；S. epidermidis主要来自人样本，S. felis主要来自猫，但两者均出现在多个宿主组。S. epidermidis和S. felis的多药耐药比例分别为43.3%和63.6%；mecA阳性S. epidermidis呈现12个ST和异质SCCmec谱，ST59和ST130均在人源和宠物源分离株中检出。上述结果提供了人–伴侣动物界面耐药CoNS的基线信息，并提示应将伴侣动物纳入抗菌药物耐药监测；但现有分型不能证明细菌传播，后续需结合更高分辨率基因组方法和流行病学数据评估人源与宠物源分离株是否相关。
关键技术方法：样本队列来自2020年7月至2021年1月中国武汉三家兽医医院，包括160份犬和猫皮肤病变拭子及100份主人鼻拭子，并记录临床和问卷数据。研究人员对分离株进行表型鉴定和16S rRNA基因测序鉴定；按CLSI M100第30版采用Kirby–Bauer纸片扩散法检测11种抗菌药物敏感性；采用PCR筛查mecA、mecC、blaZ、aacA-aphD、tetK、tetM、cfr，并以多重PCR检测ermA、ermB、ermC；对mecA阳性S. epidermidis进行MLST和SCCmec分型，与PubMLST参考ST、101个中国S. epidermidis ST及10个常见参考ST构建MST。
研究结果：
3.1 凝固酶阴性葡萄球菌分离株的分布与物种组成：基于260份样本的分离和16S rRNA基因测序鉴定，共获得268株葡萄球菌分离株，其中163株（60.8%）为CoNS，鉴定出15个CoNS种。最常见种为S. epidermidis（n=90；人67、犬11、猫12）和S. felis（n=22；人5、犬2、猫15），二者合计占全部CoNS的68.7%（112/163）。其余13个种中，S. saprophyticus（n=9）、S. cohnii（n=7）和S. haemolyticus（n=5）较多，其他种均≤5株。该结果表明伴皮肤病变伴侣动物及家庭相关人群来源CoNS具有物种多样性，S. epidermidis主要来自人、S. felis主要来自猫，但二者均可在多个宿主组检出。
3.2 CoNS分离株表型和基因型抗菌药物敏感性检测：通过纸片扩散法药敏试验和PCR耐药基因检测，S. epidermidis对SXT（75.6%）、PEN（72.2%）和ERY（50.0%）的表型耐药率最高，对OX（12.2%）和CLI（11.1%）为中等耐药，对CHL、LEV、GEN和TET低水平耐药（<7%）；43.3%的S. epidermidis为MDR，其中1株对8个不同抗菌药物类别耐药；检出基因为blaZ（90.0%）、ermC（32.2%）、mecA（26.7%）、tetK（25.6%）、aacA-aphD（24.4%）、ermB（10.0%）、tetM（6.7%）和ermA（5.6%）。S. felis对SXT（81.8%）、PEN（72.7%）和ERY（50.0%）表型耐药率最高，对CLI（36.4%）和CHL（31.8%）为中等耐药，对LEV（13.6%）、TET（9.1%）和GEN（4.5%）耐药率较低；63.6%的S. felis为MDR，其中1株对7个不同抗菌药物类别耐药；检出基因为blaZ（81.8%）、ermC（54.5%）、ermA（31.8%）、tetK（27.3%）、aacA-aphD（18.2%）和ermB（9.1%），未检出mecA、mecC或tetM。所有CoNS分离株均对LZD敏感，未检出mecC和cfr。该结果表明S. epidermidis和S. felis具有较高MDR比例及不同的耐药基因分布。
3.3 mecA阳性S. epidermidis分离株的分子分型和系统发育分析：通过mecA检测、MLST、SCCmec分型和MST分析，163株CoNS中33株（20.2%）检出mecA，包括24株S. epidermidis和来自其他5个CoNS种的9株（S. saprophyticus n=2、S. cohnii n=2、S. haemolyticus n=2、S. nepalensis n=2、S. lentus n=1）；由于非S. epidermidis各种中mecA阳性分离株有限，进一步分子表征限于mecA阳性S. epidermidis。24株mecA阳性S. epidermidis中，16株（66.7%）来自人、4株（16.7%）来自犬、4株（16.7%）来自猫；MLST和SCCmec分型鉴定出12个ST和异质SCCmec谱，ST59（6/24，25.0%）和SCCmec III（7/24，29.2%）分别为最常见ST和SCCmec型；6株ST59中5株携带SCCmec IVa并符合MDR标准，对PEN、OX、CHL、SXT、ERY、GEN和LEV耐药。基于串联管家基因序列的MLST遗传相关性分析显示两个主要簇，bootstrap值>85%：Cluster A包括ST59、ST130、ST20及相关ST，Cluster B包括ST49、ST819、ST788和ST990。若干来自不同家庭的分离株对共享相同ST及相近SCCmec型和抗菌药物耐药谱，包括H70-296与H34-200（ST59-SCCmec IVa）、H8-086与H48-243（ST20）、C17-166与C56-365（ST49）以及H52-252与D54-211（ST990）。这些结果提示不同家庭和宿主来源中存在mecA阳性S. epidermidis基因型；然而，MLST、SCCmec分型和抗菌药物耐药谱本身不能确定直接传播或近期克隆传播。将24株mecA阳性S. epidermidis ST与101个既往报道的中国S. epidermidis ST及10个PubMLST数据库中常见参考ST进行MST分析，显示MLST谱具有多样性，ST59在采样网络中占据中心位置并连接ST130、ST802和ST819等相关ST；ST59和ST130均在人源和宠物源分离株中检出；按报道地理来源分类显示ST59分布广泛，记录来自亚洲、南美洲和非洲，而ST819、ST990、ST788和ST49主要见于亚洲来源分离株。该结果表明mecA阳性S. epidermidis具有遗传多样性并在不同宿主组中出现，同时提示需采用更高分辨率基因组方法阐明其遗传关系。
讨论部分总结：本研究中CoNS占全部葡萄球菌分离株的60.8%（163/268），涉及15个种，以S. epidermidis和S. felis为主，显示伴皮肤病变伴侣动物和家庭相关人样本中CoNS的物种多样性。S. epidermidis主要来自人样本，S. felis主要来自猫，与既往报道的主要宿主关联一致；但S. epidermidis也见于犬和猫，S. felis也见于人和犬，表明两种菌均出现在多个宿主组。尽管理论上同一CoNS种可在不同宿主组检出，但仅凭种水平鉴定不能建立细菌传播或交换，需配对流行病学数据及全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）研究不同宿主分离株的潜在关系。其余CoNS中S. saprophyticus、S. cohnii和S. haemolyticus较常见；这些种与人类临床感染相关，S. saprophyticus是社区相关尿路感染的公认原因，S. haemolyticus是重要医疗相关CoNS，常涉及血流和器械相关感染，S. cohnii为偶见涉及免疫受损或住院患者感染的机会性种；其在犬和猫中检出提示伴侣动物可能携带也与人类感染相关的CoNS种，但分离株数量少，不能对其流行病学意义作确定结论。所有163株CoNS均对LZD敏感，表明LZD对该菌株集合具有体外活性；但既往已报道携带cfr等可转移耐药决定因子的LZD耐药CoNS，本研究中未检出mecC或cfr，因此mecC不能解释观察到的OX耐药表型，cfr缺失与所有分离株对LZD敏感一致。S. felis对CLI和CHL的耐药率高于S. epidermidis，S. felis中erm基因较高流行可能部分解释其较高的CLI耐药，因为erm介导的核糖体甲基化是大环内酯–林可酰胺耐药的明确机制；但CHL耐药的遗传基础仍不清楚，尤其未检出cfr，不能排除氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT）介导的失活和外排相关途径等其他机制。S. epidermidis中存在OX表型耐药与mecA携带的不一致：mecA在24/90（26.7%）中检出，但仅11/90（12.2%）在纸片扩散试验中显示OX表型耐药；24株mecA阳性分离株中13株（54.2%）纸片扩散结果为OX敏感。mecA阳性/OX敏感模式既往已在CoNS中报道，S. aureus和S. pseudintermedius中也有类似不一致，提示该现象不限于CoNS；可能解释包括mecA介导耐药的低声或异质性表型表达，但本研究未直接研究这些机制。这些发现提示在表征S. epidermidis甲氧西林耐药时，应将OX纸片扩散结果与mecA检测结果结合解释。S. epidermidis和S. felis中表型TET耐药率均低于tetK检出率，PCR检测耐药决定因子的存在，而纸片扩散测定标准化条件下的抗菌药物敏感性表型，因此仅tetK检出不能一致预测表型TET耐药；可能解释包括tetK表达降低或诱导型表达、影响基因或蛋白功能的改变以及所编码TetK外排泵活性不足，但本研究未研究这些机制，需定量转录分析和功能性外排试验澄清tetK表达对四环素耐药的贡献。ST59是本研究中mecA阳性S. epidermidis最常见的序列型；在S. epidermidis特异性MLST框架内，ST59已在不同地理区域分离株中报道，提示其广泛地理分布，但伴侣动物中S. epidermidis序列型分布和宿主关联数据仍有限。MST分析将ST59置于所分析ST网络的中心，反映其与ST130、ST802和ST819等多个采样ST的密切等位关系；ST59和ST130均在人源和伴侣动物源分离株中检出，表明其出现在两个宿主组，但MLST观察到的相关性不能证明直接传播，研究此类事件需更高分辨率基因组方法。PubMLST地理元数据表明ST59代表多个地区分离株，而ST819、ST990、ST788和ST49组成的簇主要为亚洲分离株。研究局限包括：虽在人源和伴侣动物源分离株中鉴定出密切相关的mecA阳性S. epidermidis，但无WGS和纵向流行病学数据不能确认直接传播；物种鉴定依赖16S rRNA基因测序，可能限制密切 related CoNS种的区分，一些密切 related且分离株少的CoNS种可能需额外分子方法确认；筛查仅限选定耐药决定因子，未研究dfr和sul等SXT相关耐药基因，限制对SXT耐药分子基础的解释；对OX敏感而mecA阳性、TET敏感而tetK阳性等基因型–表型不一致未进行基因表达和功能试验；研究仅在一个地理区域开展，可能限制结果外推。
研究结论翻译：本研究的发现表征了从伴皮肤病变的伴侣动物和家庭相关人类样本中回收的CoNS，尤其是S. epidermidis和S. felis的抗菌药物耐药谱。mecA阳性S. epidermidis分离株呈现多样的MLST谱，若干序列型在人源和伴侣动物源分离株中均检出。这些发现强调将伴侣动物纳入基于One Health的抗菌药物耐药CoNS监测的重要性，并为未来采用更高分辨率基因组方法进一步表征不同宿主来源mecA阳性S. epidermidis的遗传多样性、相关性和流行病学分布提供基线信息。
