《Biochimie》：Simultaneous Quantification of Total Homocysteine and Methylmalonic Acid by LC–MS/MS for Comprehensive Assessment of Vitamin B12 and Folate deficiencies
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摘要维生素B12（钴胺素）和叶酸缺乏是导致神经系统和血液系统疾病的可预防病因，尤其在脆弱人群中更为突出。功能性生物标志物如总同型半胱氨酸（tHcy）和甲基丙二酸（MMA）比循环维生素B12浓度更能敏感地反映代谢损伤。然而，由于化学结构多样性和结构相关的内源性化合物的存在，两者
摘要
维生素B12（钴胺素）和叶酸缺乏是导致神经系统和血液系统疾病的可预防病因，尤其在脆弱人群中更为突出。功能性生物标志物如总同型半胱氨酸（tHcy）和甲基丙二酸（MMA）比循环维生素B12浓度更能敏感地反映代谢损伤。然而，由于化学结构多样性和结构相关的内源性化合物的存在，两者的同时定量分析仍存在挑战性。
在此，我们提出了一种稳健的高通量液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时定量血浆、尿液和干血斑中的tHcy和MMA。该方法采用简单的蛋白质沉淀流程、高效的二硫键还原和优化的色谱分离条件，在6分钟运行时间内实现了MMA和tHcy的基线分离，无需衍生化。方法学验证显示，在生理和病理浓度范围内具有优良的线性（R2 ≥ 0.999）、精密度（CV < 5%）和准确度（偏差 < ±10%）。定量下限分别为tHcy 0.78 μmol/L和MMA 0.13 μmol/L，无显著基质效应或残留效应。
在本地参考人群（n = 400）中的临床应用证实了tHcy的年龄依赖性分布，并建立了MMA上限参考值为0.40 μmol/L，与已发表的钴胺素缺乏阈值一致。该方法有助于改善功能性维生素B12缺乏症的检测，尤其是在资源有限的地区，并已成功应用于新生儿筛查、临床研究和基础及人群研究。
引言
维生素B12（钴胺素）和叶酸缺乏是导致可预防的神经系统和血液系统表现的主要原因，影响孕妇、新生儿、老年人以及吸收不良或先天代谢缺陷患者[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。功能性生物标志物如总同型半胱氨酸（tHcy）和甲基丙二酸（MMA）比循环维生素浓度更能敏感、更早地指示与钴胺素或叶酸相关的代谢损伤，后者通常与细胞内维生素状态相关性差[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。tHcy升高反映了甲硫氨酸循环中重甲基化障碍，可由叶酸或维生素B12缺乏引起，而MMA是线粒体甲基丙二酰辅酶A变位酶活性缺陷的特异性生物标志物，该酶的辅因子为维生素B12，因此联合评估对在不同人群中准确诊断维生素B12缺乏至关重要[3]、[7]、[8]、[9]、[10]。
在临床实践中，tHcy和MMA的联合检测在评估亚临床维生素B12缺乏症、临界血清维生素浓度和代谢障碍方面日益重要[11]、[12]。与年龄相关的钴胺素吸收下降与MMA浓度升高相关，后者与较差的认知功能和虚弱相关[13]、[14]。母体高同型半胱氨酸血症和受损的一碳代谢与神经管缺陷和不良妊娠结局相关，凸显了育龄女性需要可靠生物标志物的必要性[2]、[4]、[15]、[16]、[17]。tHcy和MMA的联合评估可改善功能性维生素B12缺乏症的诊断，尤其是在血清维生素浓度处于临界值或难以判读时[18]。
tHcy和MMA的同时定量分析仍具有挑战性，因为它们的化学结构多样且存在结构相关的内源性化合物。MMA是琥珀酸（SA）的同分异构体，SA在生理浓度下存在较高水平，且在电喷雾电离–串联质谱（ESI–MS/MS）中可能共享相同的母离子/子离子跃迁。因此，准确区分需要优化的色谱分离条件以避免峰共洗脱、信号抑制或错误分配[19]、[20]、[21]、[22]。同样，tHcy以游离、氧化和蛋白质结合的二硫键形式存在，在定量前需要高效的还原步骤[23]。二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）等还原剂广泛用于此目的，但过高浓度可能导致基质效应、浊度增加或电离过程中的干扰，从而影响分析的稳健性[19]、[20]、[21]。
传统的MMA定量方法通常包括衍生化以增强保留和电离，但衍生化步骤耗时、增加操作时间并引入分析变异性[24]。例如，已报道烷基化提取方法来改善MMA检测，但这些方法需要额外的制备步骤并增加了工作流程的复杂性[23]、[29]。其他分析策略，如亲水作用色谱（HILIC）或水相正相色谱（ANP），被提出用于改善同型半胱氨酸和甲基丙二酸等高极性化合物的保留。这些方法增强了分析物的保留和与早期洗脱基质成分的分隔，但需要特定的流动相组成、严格的水分含量控制，并且在复杂生物样本中可能与增加的变异性或基质效应相关[30]、[31]。最近，简化工作流程如蛋白质沉淀或直接提取，结合同位素标记内标，已被开发用于准确和高通量定量MMA及相关代谢物，包括完全避免衍生化的方法[19]、[20]、[21]、[22]、[25]、[26]。然而，这些策略仍存在若干局限性。特别是，许多tHcy/MMA同时检测的方法仍然依赖衍生化、梯度洗脱、较长的分析运行时间、固相萃取或多步样本制备来实现足够的灵敏度和特异性[18]、[19]、[20]。这些限制可能阻碍常规实施，尤其在高通量临床实验室中，需要短运行时间、简单的工作流程和稳健的色谱区分。
液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）现已被认为是临床化学中小极性代谢物定量的金标准，因其高选择性、高灵敏度和区分MMA和SA等结构相似化合物的能力。柱技术、流动相设计和质谱仪器方面的进步进一步强化了其在临床实验室中的作用，促进了靶向代谢物面板在常规诊断中的应用[21]、[22]、[26]、[27]。然而，虽然tHcy和MMA的同时LC-MS/MS测定此前已在单一生物基质中报道过，但仍需要一种简单且统一的分析策略，能够可靠地应用于不同的生物基质。特别是，在血浆、干血斑（DBS）和尿液中使用共同的工作流程需要充分控制基质依赖性效应，同时保持MMA与SA之间足够的色谱区分，无需衍生化或大量样本制备。这样的策略可以促进tHcy和MMA测量在不同临床和筛查环境中的实施。需要注意的是，在本研究背景下琥珀酸无临床意义，但将其纳入以确保与MMA的准确区分。
在本研究中，我们开发并验证了一种稳健的LC–MS/MS方法，用于同时定量血浆、DBS和尿液中的总同型半胱氨酸、甲基丙二酸和琥珀酸，实现了MMA/琥珀酸同分异构体对的色谱分离。该方法结合了简单的蛋白质沉淀工作流程、高效的二硫键结合型同型半胱氨酸还原和短色谱分离，使得常规临床实践中的实施变得简便。重要的是，所有三个分析物在三个生物基质中通过相同的分析运行同时检测和定量。所提出的方法因此提供了一种简单、快速且经济的解决方案，用于全面评估不同生物环境中与钴胺素和叶酸相关的营养和/或代谢紊乱。
章节摘要
材料与标准品
甲基丙二酸（MMA，≥98%）、琥珀酸（SA，≥99%）和DL-胱氨酸（同型半胱氨酸的前体）分析标准品购自Fluka（瑞士布赫斯）和Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。其相应的内标D3-甲基丙二酸由Eurisotop（法国圣奥班）提供，D8-胱氨酸购自Cambridge Isotope Laboratories（美国马萨诸塞州安多弗）。二硫苏糖醇（DTT）购自Sigma-Aldrich。LC–MS级乙腈（ACN），
色谱性能与质谱检测
作为酸性化合物，MMA在正离子模式下电离时灵敏度较差。为避免衍生化步骤，使用负电喷雾电离模式（ESI-）可获得改善的MMA灵敏度。未衍生化的HCY在标准反相色谱柱上色谱保留较低。然而，使用C18改性HSS T3柱可获得可接受的保留，同时允许MMA和SA的正确色谱性能。
色谱条件经过优化，以实现保留和
讨论
在本研究中，我们开发并验证了一种稳健的LC–MS/MS方法，用于同时定量总同型半胱氨酸和甲基丙二酸，实现了MMA/琥珀酸同分异构体对的色谱分离。该方法结合了简单的蛋白质沉淀工作流程、高效的二硫键结合型同型半胱氨酸还原和短色谱分离，使得常规临床实践中的实施变得简便。验证数据表明符合ISO 15189
CRediT作者贡献声明
Elise Jeannesson：撰写—初稿、验证、监督、方法学、调查研究、数据整理、概念化。Irina Rotaru：撰写—初稿、方法学、调查研究、数据整理。Rosa-Maria Guéant-Rodriguez：撰写—审阅与编辑、验证、资源、方法学、调查研究、概念化。Jean-Louis Guéant：撰写—审阅与编辑、验证、监督、资源、方法学、调查研究、概念化。Maryline Schwartz：
未引用参考文献
[34]、[35]、[37]、[38]。
资金支持
本研究未获得公共、商业或非营利部门基金会的专项资助。
Irina Rotaru|Elise Jeannesson|Maryline Schwartz|Jean-Louis Guéant|Rosa-Maria Guéant-Rodriguez
