木犀草素靶向转肽酶 A 以抑制生物膜形成，并与万古霉素联用对抗 MRSA 所致肺炎

《Biochimie》：Diosmetin targets sortase A to inhibit biofilm formation and combines with vancomycin against MRSA-induced pneumonia

　　• 橙皮素抑制了金黄色葡萄球菌的生物膜形成，减轻了生物膜相关表型，并破坏了金黄色葡萄球菌的生物膜结构。• 橙皮素直接与SrtA结合并抑制其活性，从而削弱生物膜相关的毒力。• 橙皮素与万古霉素联用可保护小鼠免受致命的金黄色葡萄球菌肺炎侵害。• 橙皮素通过抑制焦亡相关反应，保护A549细胞免受金黄色葡萄球菌诱导的损伤。## 引言耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）因其广泛的多重耐药性而成为全球性的重大健康威胁，严重限制了相关感染的治疗选择[1]。金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）感染持续存在且难以治疗的主要贡献因素之一是其能在宿主组织和植入医疗器械上形成生物膜的能力。这些结构化的微生物群落不仅能够保护细菌免受抗生素和宿主免疫防御的侵害，还能促进耐药基因的水平转移，使得生物膜相关感染极难根除[2], [3]。鉴于这一日益严峻的挑战，迫切需要超越传统杀菌方法的新型治疗策略[4], [5]。金黄色葡萄球菌的致病性由多种毒力因子介导，这些因子协调感染的多个阶段，包括宿主黏附、定植、免疫逃逸和组织损伤[6]。近年来，"抗毒力策略"作为一种有前景的替代策略应运而生[7]。抗毒力剂并非直接杀死细菌，而是通过干扰黏附、生物膜形成和毒素产生等关键毒力相关过程来解除病原体的"武装"，同时保留细菌的活力。这种方法可能为传统抗生素提供互补策略，并有可能减轻杀菌治疗所带来的选择性压力。生物膜形成是一个复杂而动态的过程，涉及初始黏附、表面定植、细胞外基质产生和生物膜成熟[8], [9]。与表面相关的黏附素和其他细胞壁锚定蛋白在金黄色葡萄球菌初始附着到宿主组织和非生物表面的过程中发挥关键作用，从而促进后续的生物膜发展[10]。因此，干扰细菌将毒力相关蛋白呈递到细胞表面的机制，为预防生物膜形成和降低金黄色葡萄球菌致病性提供了一种合理的途径。在金黄色葡萄球菌的关键毒力相关蛋白中，分选酶A（SrtA）是一种膜锚定的半胱氨酸转肽酶，能识别含有LPXTG基序的表面蛋白，并将其共价锚定到细菌细胞壁上[11]。这些底物包括识别黏附基质分子的微生物表面组分（MSCRAMMs），如蛋白A（SpA）、凝集因子（ClfA和ClfB）、纤维连接蛋白结合蛋白（FnBPA和FnBPB）以及丝氨酸-天冬氨酸重复蛋白（SdrC、SdrD和SdrE），它们参与宿主黏附、定植、免疫逃逸和生物膜形成[12]。重要的是，SrtA对细菌生长和存活并非必需，使其成为抗毒力干预的理想靶点[13]。因此，抑制SrtA可能同时干扰多个毒力相关过程，代表了一种开发金黄色葡萄球菌感染辅助治疗策略的有前景的方法[14]。橙皮素是一种天然存在于柑橘类水果中的黄酮类化合物，据报道具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤作用[15]。先前的研究提供了初步证据，表明橙皮素可能通过降低*hla*和*agrA*的表达并减少Hla的产生，对金黄色葡萄球菌发挥抗毒力活性，从而保护A549细胞免受金黄色葡萄球菌诱导的损伤[16]。橙皮素还在体外表现出与红霉素对MRSA具有协同治疗效果[17]。然而，目前尚缺乏对其关键毒力表型（尤其是生物膜形成）的影响及其在相关动物感染模型中治疗效果的系统研究。在本研究中，我们首先在小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型中评估了橙皮素与万古霉素联用的治疗潜力。随后，我们表征了其对生物膜相关毒力表型的影响，并通过虚拟筛选及后续的生化与生物物理验证确定了SrtA作为分子靶点。使用*srtA*缺失突变株进一步评估了SrtA的关键作用。最后，在A549细胞和大蜡螟（*G. mellonella*）感染模型中探索了橙皮素对宿主的保护作用。综上，本研究为橙皮素对金黄色葡萄球菌的抗毒力活性提供了证据，并支持其作为抗生素辅助剂治疗MRSA相关感染的潜力。## 各章节摘要### 菌株、动物、昆虫、细胞和试剂本研究使用的金黄色葡萄球菌菌株包括MRSA USA300（ATCC BAA-1717）、MRSA F-182（ATCC 43300）、MSSA Newman（ATCC 8325）、临床分离株SA37和SA1B5B，以及Newman的*srtA*缺失突变株（Newman-Δ*srtA*），均保存于本实验室。携带pET28a-*srtA*、pET28a-*clpP*、pET32a-*agrA*和pET28a-*mgrA*质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株用于表达和纯化蛋白质，以进行细胞热移位分析（CETSA）。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在胰酪大豆肉浸液（TSB，货号### 橙皮素在金黄色葡萄球菌诱导的致死性肺炎小鼠模型中的抗感染作用为评估橙皮素在体内的治疗潜力，我们建立了金黄色葡萄球菌诱导的肺炎小鼠模型（图1A）。小鼠经鼻感染USA300、F-182或Newman菌株，并监测其存活率。在USA300感染的小鼠中，96小时的存活率仅为10%。单独使用橙皮素（50 mg/kg）或万古霉素（50 mg/kg）治疗分别将存活率提高至40%和50%，而两者联用则显著将存活率提高至90%（图1B）。类似### 讨论在后抗生素时代，MRSA等多重耐药病原体的全球蔓延使许多抗生素失效。抗毒力策略通过靶向致病性而非细菌活力，提供了一种有前景的替代方案[7]。通过抑制毒力因子的表达或活性，细菌表现出降低的定植宿主能力。与传统抗生素不同，这种方法不会直接消除细菌病原体，因此### 结论总之，我们揭示了橙皮素与万古霉素联用在金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型中的治疗效果。此外，橙皮素被鉴定为SrtA的抑制剂，能有效破坏生物膜形成的初始阶段。橙皮素对宿主的保护能力在细胞和无脊椎动物感染模型中均得到了进一步验证（图7）。总之，橙皮素是一种强效的抗毒力抑制剂，值得进一步研究其### 作者贡献声明**金梦丽：** 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，软件，方法论，调查研究，形式化分析，概念化。**周东岳：** 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，软件，方法论，调查研究，形式化分析，概念化。**李明然：** 撰写——初稿，数据整理。**孔翔日：** 可视化，调查研究。**蒋双：** 监督，资源。**李清杰：** 验证，软件。**唐雅婷：** 可视化，方法论，### 数据可用性声明本研究中生成和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。### 伦理审批动物实验程序严格依照中国《动物福利法》和《实验动物管理条例》进行，并获得了长春中医药大学动物福利与伦理委员会的批准（批准号：2023358）。### 作者协议我们声明，本手稿题为"橙皮素靶向分选酶A抑制生物膜形成并与万古霉素联用对抗MRSA诱导的肺炎"为原创作品，此前未曾发表，目前也未在其他地方接受审稿。我们确认所有署名作者均已阅读并批准该手稿，且没有其他满足作者资格但未列出的人员。我们进一步确认所列作者顺序### 资助信息本研究得到以下基金支持：吉林省教育厅科学研究项目基金（编号：JJKH20261341KJ、JJKH20261469KJ和JJKH20250649KJ），中华中医药学会中医药产业基金会、中国中医科学院（编号：CXLH-2025009）以及长春中医药大学青年优秀学科骨干培养计划（编号：202315）。资助方参与了本研究的部分费用承担，并在研究设计、### 利益冲突声明作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：魏林报告了由吉林省教育厅科学研究项目基金提供的财务支持。周丽亚报告了由吉林省教育厅科学研究项目基金提供的财务支持。宋武报告了由中华中医药学会中医药产业基金会提供的财务支持。金梦丽|周东岳|李明然|孔翔日|蒋双|李清杰|唐雅婷|朱舒悦|王岩|孙卫芳|韩少宇|魏林|周丽亚|宋武