《Biochimie》：Divergent Effects of
Trichomonas vaginalis on Cervical Cancer Cells HPV-positive and HPV-negative: Interplay with Purinergic Signaling
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研究人员在离体（ex vivo）模型中发现，阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）可促进细胞增殖和血管形成。阴道毛滴虫-嘌呤能信号对HPV阴性的C33A细胞具有细胞毒性，但对HPV阳性的SiHa细胞未显示细胞毒性。阴道毛滴虫可降低SiHa细胞
研究人员在离体（ex vivo）模型中发现，阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）可促进细胞增殖和血管形成。阴道毛滴虫-嘌呤能信号对HPV阴性的C33A细胞具有细胞毒性，但对HPV阳性的SiHa细胞未显示细胞毒性。阴道毛滴虫可降低SiHa细胞的白介素-6（IL-6）产生和E6癌基因表达。在SiHa细胞中，Ki-67表达受到阴道毛滴虫及三磷酸腺苷（ATP）/腺苷（Ado）代谢的调节。
阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）是常见非病毒性性传播感染滴虫病（trichomoniasis）的病原体，全球每年新发病例约1.56亿，但诊断方法灵敏度低、药物耐药性上升以及大量无症状感染使其成为被忽视的感染。该寄生虫无法从头合成嘌呤环，必须依赖宿主细胞外核苷酸，尤其是腺苷（Ado）维持生存。流行病学荟萃分析提示阴道毛滴虫感染可能增加宫颈癌发生风险，但其分子机制尚不清楚。宫颈癌是全球第四大女性癌症，人乳头瘤病毒（HPV）阳性与HPV阴性宫颈癌的生物学行为不同，HPV阴性鳞状细胞癌预后更差。嘌呤能信号传导（purinergic signaling）通过ATP-Ado轴调节炎症、免疫抑制、血管生成和肿瘤生长，而阴道毛滴虫本身依赖细胞外腺苷并影响局部嘌呤代谢。因此，研究人员利用HPV阳性SiHa和HPV阴性C33A宫颈癌细胞系以及离体宫颈组织，探究阴道毛滴虫是否通过嘌呤能信号传导差异性地影响宫颈癌细胞行为，从而为滴虫感染与宫颈癌的关联提供机制线索。
在技术方法上，研究人员收集了两例患者子宫切除标本的鳞柱交界部活检组织用于离体共培养；体外采用HPV-16阳性SiHa（ATCC HTB-35）和HPV阴性C33A（ATCC HTB-31）细胞系，阴道毛滴虫使用ATCC 30236标准株及临床分离株TVLAC-M6和TVLAC-M15，后者来源于巴西南里奥格兰德联邦大学药学院临床分析与毒理学实验室伦理批准项目。通过MTT法（四甲基偶氮唑盐比色法）测定细胞活力，确定感染复数（MOI）为2:1（虫体:细胞）、共培养24小时作为后续条件。研究人员使用外源性ATP或Ado以及NTPDase/CD39抑制剂钆（gadolinium）、CD73抑制剂AMPCP、腺苷脱氨酶抑制剂EHNA、腺苷转运体抑制剂双嘧达莫（dipyridamole）进行嘌呤能信号干预；采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测E6和Ki-67基因表达，采用Lumit免疫分析检测IL-6分泌；同时制备条件培养基（CM）并进行96小时活力动力学检测。
3.1 阴道毛滴虫在离体模型中引起上皮增生、血管增加和炎症过程
离体宫颈活检组织与阴道毛滴虫共培养24小时后，组织切片可见鳞状上皮增生伴角化，间质和上皮下乳头内血管增多，并出现淋巴细胞浸润；对照组则表现为富含糖原的鳞状上皮，血管和炎症细胞极少。该结果表明阴道毛滴虫可在短期内诱导宫颈组织的炎症反应、血管形成和组织重塑相关改变。
3.2 细胞生长速率测定、感染复数与孵育时间
研究人员通过96孔板确定SiHa和C33A的最适接种密度；随后检测不同感染复数（MOI）和孵育时间，确定2:1（虫体:细胞）、24小时可维持约60%–80%细胞活力。ATCC 30236与临床分离株TVLAC-M6行为相似，因此后续实验选用ATCC 30236株。
3.3 嘌呤能信号调节在C33A和SiHa中表现出相反的滴虫细胞毒性模式
在HPV阴性C33A细胞中，阴道毛滴虫本身具有细胞毒性；加入ATP或Ado后细胞毒性无显著变化，但加入ATP加CD39抑制剂钆，或Ado加CD73抑制剂AMPCP、腺苷脱氨酶抑制剂EHNA和腺苷转运体抑制剂双嘧达莫后，细胞活力进一步降低，表明阻断ATP/Ado降解会增强阴道毛滴虫的杀伤作用。在HPV阳性SiHa细胞中，外源性ATP或Ado反而逆转了阴道毛滴虫引起的细胞毒性；阻断ATP/Ado降解并未增强细胞毒性。这说明HPV状态可能影响嘌呤能信号在滴虫-宫颈癌细胞相互作用中的调节方向。
3.4 条件培养基引起C33A时间依赖性活力下降和SiHa稳定下降
将阴道毛滴虫与宫颈癌细胞共培养后的条件培养基（CM）重新作用于细胞，C33A细胞在48小时起出现显著活力降低，并随时间延长持续下降；SiHa细胞在24小时出现轻微降低后保持稳定至96小时。该结果表明两种细胞系对滴虫分泌产物的敏感性存在差异。
3.5 条件培养基-嘌呤能信号（CM-PS）不影响细胞活力
与CM相比，在制备CM过程中加入ATP或Ado以及相应抑制剂所获得的条件培养基（CM-PS）对C33A和SiHa细胞活力的影响并无显著改变。该结果提示嘌呤能信号主要调节阴道毛滴虫与宫颈癌细胞接触依赖性的细胞毒性，而不影响虫体和细胞释放的分泌产物的毒性。
3.6 阴道毛滴虫降低SiHa细胞IL-6产生
与单独培养的SiHa细胞相比，存在阴道毛滴虫时IL-6释放减少；在ATP、Ado及嘌呤能信号相关抑制剂存在的情况下，IL-6降低更明显。该结果与既往研究显示滴虫可刺激原代阴道上皮细胞产生细胞因子的现象不同，提示HPV阳性宫颈癌细胞对滴虫的炎症反应具有特殊性。
3.7 阴道毛滴虫对E6癌基因表达的影响
RT-qPCR结果显示，存在阴道毛滴虫时，SiHa细胞中HPV相关E6癌基因的表达降低；加入ATP、Ado或相关抑制剂后，E6表达进一步下降。E6是HPV的重要致癌蛋白，其表达降低与IL-6下降和细胞活力降低一致，提示滴虫可能通过对E6表达的抑制而影响HPV阳性宫颈癌细胞的生存信号。
3.8 阴道毛滴虫损害SiHa细胞的Ki-67表达
Ki-67是细胞增殖标志物。阴道毛滴虫单独存在时，SiHa细胞Ki-67基因表达降低；加入ATP加CD39抑制剂钆，或Ado加EHNA、AMPCP和双嘧达莫时，Ki-67表达亦降低。然而，外源性ATP或Ado与滴虫共同存在时，Ki-67表达的降低被逆转，接近单独细胞对照组水平。该结果提示滴虫可通过消耗细胞外腺苷等代谢机制影响SiHa细胞增殖信号。
在讨论部分，研究人员指出，阴道毛滴虫感染引起的炎症和组织损伤可能是其与宫颈癌关联的基础，但本研究在所用条件下未观察到滴虫促进宫颈癌进展。嘌呤能信号在接触依赖性细胞毒性中具有重要作用：在HPV阴性C33A细胞中，抑制ATP/Ado降解会减少滴虫可摄取的Ado，从而增强细胞毒性；在HPV阳性SiHa细胞中，该细胞系高表达NTPDase和CD73，可高效水解ATP并产生Ado，滴虫摄取Ado后减轻了细胞外Ado的细胞毒作用。滴虫与SiHa共培养降低IL-6和E6表达，且Ki-67下降，提示滴虫可能对HPV阳性细胞的增殖和致癌信号产生拮抗作用。外源性ATP/Ado恢复Ki-67表达可能与腺苷脱氨酶代谢产物如肌苷、次黄嘌呤的保护效应有关。研究人员强调，离体模型中的炎症和血管生成反应提示滴虫可能参与肿瘤相关微环境改变，但需长期和更复杂的模型验证因果关系。
研究结论可概括为：本研究检验了阴道毛滴虫与宫颈癌关联的假说。结果表明，在所测试条件下，阴道毛滴虫并未促进宫颈癌进展；相反，它在体外诱导HPV阴性C33A和HPV阳性SiHa细胞毒性，并在离体组织中诱导炎症反应；嘌呤能信号调节虫体与宫颈癌细胞接触时的相互作用，但不影响分泌产物。阴道毛滴虫与嘌呤能信号调节共同作用可降低E6和Ki-67表达，显示对SiHa细胞肿瘤进程有直接影响。离体模型提示需在更复杂模型中研究滴虫的效应。因此，这些发现是肿瘤微环境中癌症相关过程的可能机制，但仍需更长期和更复杂的实验模型以确立因果关系。
