Polycomb相关因子PHF19缺失促进MLL-AF9驱动急性髓系白血病干性并构建PHFScore预后评分

《SCIENCE ADVANCES》：Polycomb factor PHF19 affects AML initiation, patient prognosis, and survival

　　

急性髓系白血病（AML）以未分化髓系细胞失控性扩增为标志。尽管MLL-AF9等致癌融合可启动疾病，但白血病发生的早期步骤及细胞内在调控因子的作用仍未明确。研究人员既往证明，Polycomb相关因子Phf19是小鼠造血干细胞（HSC）维持与状态控制所必需，且其缺失（Phf19KO）会损害HSC功能。为界定Phf19在转化过程中的作用，研究人员在Phf19KO造血细胞中表达MLL-AF9，并开展整合性多组学分析。Phf19缺失促进干性特征的获得，并降低对分化诱导性AML治疗的反应性。Phf19缺失的分子与功能后果与AML患者数据集中的观察结果相平行。基于这些数据，研究人员构建了预后特征PHFScore，其揭示此前未被识别的AML生存相关基因，并可在不同细胞起源和白血病发生阶段稳健地对患者进行分层，从而突显Phf19在AML生物学与预后中的关键作用。

急性髓系白血病（AML；以未分化髓系细胞失控扩增为特征的异质性恶性肿瘤）存在广泛的遗传与表观遗传改变，MLL-AF9融合是预后不良AML亚群中的典型致癌驱动。尽管治疗取得进展，表观遗传调控尤其Polycomb抑制复合物2（PRC2；催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化修饰的多蛋白复合物）在疾病发病、治疗抵抗及个体表观遗传易感性中的作用仍需阐明。TET2、DNMT3A、EZH2等单基因改变可破坏造血稳态，染色质相关蛋白异常可促进白血病发生。研究人员既往建立Phf19KO小鼠，发现Polycomb相关因子Phf19对造血干细胞（HSC；维持血液生成的干细胞）维持和状态控制重要，其缺失导致HSC功能受损、脾大、干性异常、髓系分化偏倚及白血病前转录特征，提示Phf19缺失可能使细胞更易发生不同于正常背景的白血病。然而，Phf19在白血病转化早期和患者预后中的作用尚不明确，AML风险分层亦需改进。为此，研究人员在Phf19KO与Phf19FF造血干/祖细胞（HSPC；可分化为血液细胞的干/祖细胞）中表达MLL-AF9，开展整合多组学分析，并结合AML患者数据集，解析Phf19缺失对转化、干性、治疗反应和预后的影响，构建PHFScore预后特征。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法包括：原代小鼠骨髓Lin^– HSPC的Phf19FF与Phf19KO模型、MLL-AF9逆转录病毒转导及集落形成实验；流式细胞术免疫表型与Cd11b分化检测；Ara-C和ATRA处理；bulk RNA-seq、H₃K₂₇me₃ CUT&Tag及H₃K₂₇me₃/Suz12 ChIP-seq；单细胞RNA测序（scRNA-seq；单细胞水平转录组测序，PISA/Seurat）与单细胞ATAC测序（scATAC-seq；单细胞水平染色质可及性检测，Cell Ranger/ArchR）；CIBERSORTx（基于支持向量回归的转录组去卷积算法）；公共队列TCGA-LAML、BEAT-AML、AML-PMP及LSC数据集GSE199452。

研究结果如下。Phf19 mRNA levels correlate with AML prognosis：研究人员分析TCGA-LAML和BEAT-AML中年轻/成人AML患者，按PHF19转录水平四分位分组，发现低PHF19（AML-PHF19Low）与较差生存相关，其他Polycomb基因无一致生存差异；转录组和基因集富集分析（GSEA；评估预设基因集在排序基因表中的富集程度）显示低PHF19组富集HOX等干性基因，高PHF19组偏髓系分化状态。MLL-AF9_Phf19KO cells are more clonogenic and less sensitive to differentiation-inducing compounds：通过MLL-AF9转化Phf19KO/FF HSPC并连续集落培养，KO细胞克隆性和细胞数增加，早期LK⁺多能群体富集；对ATRA及Ara-C诱导的Cd11b分化反应降低。患者中AML-PHF19Low完全缓解率显著较低。CUT&Tag、ChIP-seq和RNA-seq显示KO细胞成熟造血基因H₃K₂₇me₃升高、表达降低，HSC相关基因表达升高，视黄酸通路受表观抑制。scRNA-seq analysis reveals an aggressive transcriptomic profile for all MLL-AF9_Phf19KO populations：scRNA-seq投影参考图谱发现KO各群体包括成熟样群体呈更原始/干性转录程序，Hoxa5、Stfa1、Cstdc5、Hopx等侵袭相关基因较高、Cd48较低，且与AML-PHF19Low患者转录组相似。scATAC-seq analysis identified stem-progenitor chromatin marks in MLL-AF9_Phf19KO cells：scATAC-seq显示KO晚期启动子转录起始位点（TSS；转录起始区域）可及性升高，差异峰呈双相变化；HSC-MPP相关位点更开放，CMP-GMP位点在FF更强；白血病干细胞（LSC；具致白血病能力的干细胞）维持/生存相关转录因子（TF；调控基因转录的蛋白）基序如Pbx3、Runx、Sfpi1活跃。Phf19-low expression correlates with a stemlike transcriptome and a higher leukemogenic potential：CIBERSORTx去卷积显示AML-PHF19Low富集primitive-like，PHF19High富集GMP-like；78例分选骨髓LSC数据中LSC-PHF19Low均可在体内致白血病，CD34⁺ LSC-PHF19Low呈更原始转录谱。The PHFScore molecular signature predicts AML prognosis：研究人员从TCGA和BEAT一致生存相关基因中筛选六基因（ALDH1A1、CARMIL1、HOPX、CALR、STAR、PHF19）构建PHFScore；在TCGA-LAML、BEAT-AML和AML-PMP中PHFScoreHigh预后较差，年龄校正后仍与总体生存（OS；从诊断至末次随访或死亡的时间）显著相关，分层性能与LSC17相当。

讨论指出PHF19为PRC2辅助亚基，既往在慢性髓系白血病（CML）和t(8:21) AML中研究其耗竭，但未考虑正常细胞在转化前的状态；本研究显示Phf19缺失建立白血病前状态，MLL-AF9转化后获得克隆性优势、暂时干性免疫表型及H₃K₂₇me₃在成熟基因上的累积，HSC基因不抑制而略高；患者低PHF19与干性、化疗耐药相关；scRNA-seq显示KO各群体具干性/侵袭相关核心基因但未出现HSC转录身份；scATAC-seq提示双相表观开关和LSC相关TF富集；PHFScore结合scRNA-seq与AML队列标志物，较单用PHF19改善分层，HOPX、ALDH1A1、CALR有已知关联，STAR与CARMIL1在白血病中尚未研究。研究结论翻译：总之，研究人员整合多种方法并进行不同组学分析，以研究表观遗传改变（Phf19KO）血液细胞来源白血病的分子和生化特征。研究人员证明MLL-AF9_Phf19KO细胞在免疫表型、转录、表观遗传和功能水平呈现更高干性。通过将体外多组学数据与多个AML数据集的分子和临床数据整合，研究人员成功识别用于判断患者预后的分子特征PHFScore。最后，研究人员识别有前景的生存相关基因如STAR和CARMIL1，其在AML中的潜在作用仍未知。