PhagoID：定量原位邻近标记解析跨物种、成熟及免疫激活状态下含微珠与微生物吞噬体腔蛋白组

《SCIENCE ADVANCES》：PhagoID: Quantitative in situ proximity labeling defines the proteomes of bead- and microbe-containing phagosome lumina across species, maturation, and immune activation

　　

吞噬体（phagosome）是一种免疫细胞器，整合来自多种货物的信号，驱动病原体杀伤、组织稳态和抗原提呈（antigen presentation）。该区室如何协调这些多样功能仍未被完全理解。对跨细胞状态和扰动下吞噬体组成的全面认识可加速对其调控的理解。在此，研究人员建立了PhagoID，一种模块化邻近标记（proximity labeling）方法，可在活细胞中对吞噬体腔进行原位蛋白组学（proteomic）分析。将PhagoID应用于小鼠和人巨噬细胞（macrophage），研究人员定义了保守及物种特异性的吞噬体蛋白组，其中既包括经典溶酶体（lysosome）组分，也包括来自核、线粒体和内质网（endoplasmic reticulum，ER）区室的意外贡献者。将这些蛋白组与25项吞噬体表型的全基因组CRISPR筛选（genome-scale CRISPR screens）整合，研究人员鉴定了一个腔蛋白网络，调控货物摄取、酸化、抗原提呈和微生物控制，并突显了此前未被认识的吞噬体效应因子。研究人员随后调整PhagoID以分析含微生物的吞噬体，并比较无菌微珠吞噬体与含Escherichia coli（E. coli）的吞噬体，证明存在适度的E. coli吞噬体重塑特征。比较分析进一步揭示，LAMP1缺失增强了ER来源蛋白向吞噬体的募集，而TFEB缺失尽管在溶酶体生物发生中发挥作用，却对腔蛋白组影响极小。最后，细胞因子刺激重塑吞噬体腔，在I型和II型干扰素（type I and II interferons）响应下富集参与抗原提呈和抗菌活性的蛋白。这些数据表明，PhagoID提供了吞噬体腔的高置信度、定量和整合图谱，揭示了先天免疫中此前未被识别的细胞器通讯和调控控制轴。

论文解读：PhagoID——定量原位邻近标记解析吞噬体腔蛋白组

研究背景：吞噬体（phagosome，专业吞噬细胞吞入货物后形成的动态细胞器）整合代谢、化学和蛋白信号，参与病原体清除、凋亡碎片清除和抗原提呈。其组成复杂且依赖情境。既往活细胞显微镜和荧光实验揭示吞噬体成熟动态及酸性、蛋白酶、氧化还原特征，但缺乏系统认识哪些蛋白产生这些表型。基于细胞分级分离的吞噬体蛋白组学受其他细胞器污染、破裂导致腔蛋白丢失和高细胞输入量限制，尤其原代人吞噬细胞。因此需要原位、定量、低输入且能区分真实腔resident与污染物的方法。研究人员建立PhagoID，论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。该研究将吞噬体货物表面偶联邻近标记酶，在活细胞中原位标记腔蛋白，结合定量质谱和功能基因组数据，构建跨物种、成熟、遗传扰动和免疫激活的吞噬体腔图谱，为先天免疫细胞器通讯和调控提供框架。

关键技术方法：PhagoID将HRP（horseradish peroxidase）偶联于微珠或经SpyTag/SpyCatcher共价偶联于E. coli表面，在AP/BP底物与H₂O₂下催化腔蛋白原位生物素化；以TMT（tandem mass tag）多重质谱定量蛋白组，以LFQ（label-free quantitative）质谱比较HRP微珠与HRP–E. coli吞噬体；整合25项全基因组CRISPR筛选（genome-scale CRISPR screens）进行meta分析；采用PhagoFACS（单吞噬体流式细胞术）验证候选蛋白。样本来源：iBMDMs（immortalized bone marrow–derived macrophages）；hMDMs（human monocyte–derived macrophages）由马萨诸塞州总医院商业获取的去标识buffy coats中CD14⁺单核细胞经M-CSF分化6天；FLAMs（fetal liver–derived alveolar-like macrophages）。

研究结果：
1. 吞噬体内邻近标记蛋白组学（PhagoID）的开发：比较TurboID、APEX2和HRP在吞噬体pH范围活性，HRP在pH 4.5保留最高活性；免疫荧光显示HRP微珠催化标记依赖底物并局限于吞噬体；AP较BP进入快、标记强、信噪比高；DPI抑制内源性H₂O₂背景。结论：建立兼容酸性吞噬体的HRP基PhagoID。
2. PhagoID鉴定吞噬体腔resident蛋白及既往筛选中欠研究效应因子：iBMDMs中HRP微珠对BSA微珠，TMT-MS定量2536个小鼠蛋白，筛出195个显著富集；与25项CRISPR筛选整合，100个至少涉及一项，30个涉及两项以上；与5项既往研究定义43个核心腔蛋白组。结论：捕获经典溶酶体/质膜组分及核、线粒体、ER来源的意外效应因子。
3. PhagoID解析低细胞输入的原代人巨噬细胞吞噬体腔：5名供者hMDMs，每重复25 million细胞，定量1016个人蛋白，筛出123个显著富集；溶酶体和线粒体富集，核和胞质相对耗竭；NADPH氧化酶组分p22^phox/gp91^phox在hMDM中较高。结论：低输入可实现原代人吞噬体腔分析并揭示物种差异。
4. PhagoFACS验证iBMDM和hMDM吞噬体蛋白：单吞噬体流式验证prosaposin、cathepsin B/D、FUBP2、ZNF207、p22^phox；cathepsin B/D呈双峰异质性，prosaposin较均匀；ZNF207见于iBMDM而非hMDM，p22^phox在hMDM较高。结论：单吞噬体水平验证PhagoID命中及物种差异。
5. PhagoID适配含微生物吞噬体并揭示30 min E. coli吞噬体蛋白组的适度改变：SpyTag-SpyCatcher共价将HRP偶联E. coli表面并在pH 4.5保留；30 min LFQ比较HRP微珠与HRP–E. coli吞噬体，多数蛋白共享或轻度富集；E. coli特异包括GSTP2、PLA2G15、recycling endosome蛋白、COLEC12、RNF213、SQSTM1。结论：DH5α早期重塑适度，但可见宿主识别和ROS/膜修复相关特征。
6. PhagoID提供吞噬体成熟及细胞器贡献的时间分辨理解：iBMDMs 30/60/120 min定量2581个蛋白；早期质膜蛋白如CD44、ATP1B3、SLC2A1、ITGB2下降，溶酶体酶prosaposin、cathepsin B/D、LAMP1、GPNMB、HEXA/HEXB上升；单调增加蛋白富集溶酶体通路；ER和线粒体贡献相对稳定。结论：成熟以溶酶体融合为定义性生化转变，并显示持续细胞器交换。
7. PhagoID模块性支持遗传敲除和外源信号下吞噬体组成研究：LAMP1 KO与TFEB KO iBMDMs 60 min；TFEB缺失仅少量溶酶体蛋白变化；LAMP1缺失136个差异蛋白，多数增加，ER来源蛋白显著富集；IFN-γ或IFN-β刺激FLAMs 24 h后30 min分析，120个差异蛋白中105个上调，共享IFN签名包括GBP2/4/5/6/7、IRGM1-3、OAS1a/OAS3、RNF213、IRG1，抗原加工提呈TAP1、TAPASIN、H2-K1、H2-D1；与Trost et al.总吞噬体分析及Gilliland et al. FLAM转录组一致。结论：LAMP1调控ER-吞噬体连接，TFEB对基础腔蛋白组影响小，I/II型IFN汇聚重塑吞噬体腔。

讨论总结：讨论指出，PhagoID通过将HRP偶联到货物而非假定吞噬体标志物，避免依赖独占标志物，保留细胞器完整性，并以比率过滤污染物；其图谱重现LAMP1、cathepsins等已知组分，并揭示核、线粒体、ER来源蛋白，提示吞噬体与多细胞器通讯。与CRISPR筛选整合将腔蛋白与摄取、酸化、抗原提呈和细菌控制网络连接，提名EP300、HNRNPF、HNRNPL、FUBP2/Khsrp、ZC3HAV1、CNBP、NUFIP2等意外效应因子；FUBP2和ZNF207的验证提示核蛋白可能在吞噬体发挥核酸监视相关作用；SOD2等线粒体蛋白提示线粒体-吞噬体相互作用具选择性。LAMP1缺失增加ER腔蛋白募集，TFEB缺失影响小；IFN-γ/IFN-β共享抗原提呈和抗菌程序。局限包括过氧化物酶依赖腔可及酪氨酸、需H₂O₂、不能测活性、批量样本异质性、跨物种技术变异和抗体限制。

研究结论（译）：这些数据表明，PhagoID能够对吞噬体腔进行定量、高置信度图谱绘制，并提名此前未知的功能研究候选物。该方法提供可适应框架，用于比较不同货物、扰动和细胞状态下的吞噬体组成。尽管本研究使用HRP偶联微珠，同一策略可扩展至微生物或凋亡货物等多样靶标，并与APEX2等替代酶配对以探查受损或应激响应吞噬体。PhagoID通过提供更高的腔特异性及与低细胞输入量的兼容性，补充了新兴的细胞器免疫沉淀方法，扩大了对cDC1s或人组织驻留巨噬细胞等稀有原代细胞的访问。未来将邻近标记与脂质组学或代谢组学整合，将继续加深对吞噬体组成和细胞器间通讯如何塑造先天免疫功能的理解。