《Biomaterials》：Programming a Pro-Regenerative Microenvironment via a Photocurable Albumin-Matrix Hydrogel for Hepatic Tissue Reconstitution
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•光固化BSA-MA-dECM水凝胶维持肝细胞活力和功能。•BSA-MA-dECM水凝胶诱导促再生M2巨噬细胞极化。BSA-MA-dECM水凝胶通过VEGF/FGF和PI3K–AKT信号通路增强血管新生。•工程化肝脏组织减轻四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化。引言鉴于供体肝脏持续短
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光固化BSA-MA-dECM水凝胶维持肝细胞活力和功能。
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BSA-MA-dECM水凝胶诱导促再生M2巨噬细胞极化。BSA-MA-dECM水凝胶通过VEGF/FGF和PI3K–AKT信号通路增强血管新生。
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工程化肝脏组织减轻四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化。
引言
鉴于供体肝脏持续短缺，肝脏组织工程(LTE)已成为肝脏移植的有前景的替代方案[1], [2]。LTE通常将肝细胞或干细胞与生物材料结合，构建三维(3D)微组织，以重现天然肝脏架构和生理的关键特征[2], [3]。过去十年间，多种LTE策略，包括细胞片、贴片移植、海藻酸钙包封的肝细胞、去细胞支架基构建物和3D生物打印组织，均显示出治疗肝损伤的潜力[4], [5], [6], [7]。然而，LTE仍面临若干关键挑战。首先，原代肝细胞在体外容易发生失巢凋亡，导致细胞极性丧失和功能下降[8], [9]。此外，移植物免疫原性和手术操作可能引发炎症和免疫排斥，损害移植细胞的存活和功能[5], [10]。再者，血管化不足会损害移植物的存活、功能和增殖[8], [11]。因此，维持肝细胞极性、调节炎症和加速血管化对于推进LTE的临床转化至关重要。生物材料有望解决这些挑战。它们不仅能模拟细胞外基质(ECM)微环境以保留肝细胞极性和功能，还能调节免疫细胞极化并促进血管新生[12], [13], [14]。
血清白蛋白是一种内源性非糖基化蛋白，约占血浆总蛋白的60%[15]。作为生物材料，白蛋白因其易得性、稳定性、可持续性、非免疫原性和低成本而在临床上极具吸引力[16], [17]。此外，白蛋白可从患者体内提取，进一步降低免疫风险并实现个性化治疗[16]。基于白蛋白的水凝胶可模拟ECM并支持多种细胞的三维培养，包括干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞和肝细胞癌细胞[16], [18]。它们还可作为支架用于伤口愈合、脊髓修复和骨再生等再生应用[19], [20], [21], [22]。此外，基于白蛋白的水凝胶具有免疫调节作用。例如，光交联白蛋白水凝胶可抑制巨噬细胞活化并减少促炎因子的表达，包括白介素-6 (IL-6)、白介素-8 (IL-8)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)[23]。白蛋白还可作为涂层基质，通过减少脑驻留细胞的粘附和促炎及神经毒性细胞因子的分泌，增强中枢神经系统记录电极的生物相容性[24]。尽管具有优异的生物相容性和免疫调节特性，基于白蛋白的水凝胶缺乏多样化的生物活性成分[16]。因此，将ECM衍生的生物活性成分掺入白蛋白水凝胶中构建复合水凝胶，是解决这一局限性的有效策略。
去细胞细胞外基质(dECM)提供了一种互补策略，用于提供组织特异性生物化学和生物物理线索[25]。dECM通过去除细胞和核成分同时保留ECM的组成和结构来生成，使其广泛应用于再生医学中重建整个器官和组织，如肝、心、肺和肾[25], [26], [27]。dECM可通过酶促水解加工成水凝胶，在此过程中会释放被称为基质细胞因子的生物活性肽[28]。基质细胞因子被认为是dECM生物活性在多种生物过程中的关键介质，包括细胞粘附、增殖、分化、功能成熟、极性建立、组织修复与重塑、血管新生和免疫调节[28], [29]。此外，dECM支架和水凝胶可保留生长因子，包括成纤维细胞生长因子 (FGF)、表皮生长因子 (EGF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、结缔组织生长因子 (CTGF)和转化生长因子 (TGF)，从而支持内皮细胞增殖和迁移，并促进体外和体内的血管化[30], [31], [32]。dECM水凝胶还可作为细胞载体来募集宿主内皮细胞并加速新生血管形成。我们先前的研究表明，肝脏dECM支架表现出很强的促血管新生潜力，并增强移植的原代肝细胞或间充质干细胞 (MSC) 球体的血管化[8], [11]。同样，肝脏dECM水凝胶提供组织特异性三维微环境，支持血管新生和植入物与宿主组织的整合[33], [34]。
维持肝细胞极性、调节炎症和加速血管化仍是LTE的核心挑战。在此，我们开发了一种生物仿生复合水凝胶，将白蛋白的良好生物相容性与肝脏dECM的组织特异性生物活性相结合。我们合成了光交联牛血清白蛋白甲基丙烯酸酯 (BSA-MA)，并将其与源自α1,3-半乳糖基转移酶敲除 (GTKO) 猪肝的肝脏dECM混合。我们首先评估了通过混合不同比例的BSA-MA和肝脏dECM制备的BSA-MA-dECM溶液的交联效率，随后表征了水凝胶的物理化学性质、细胞相容性和组织相容性。我们进一步评估了水凝胶在体外和体内的免疫调节和促血管新生能力，随后分析了其潜在的促血管新生机制。将原代肝细胞球体包封在BSA-MA-dECM水凝胶中以构建工程化肝脏组织 (EHT)。在体外评估肝细胞活力和功能。将EHT植入肝损伤大鼠网膜后，评估肝细胞扩增和血管新生情况。最后，通过血清生化检测、组织学检查和转录组测序评估EHT对肝损伤的治疗效果（图1）。
章节摘要
BSA-MA的合成与表征
BSA-MA是通过牛血清白蛋白 (BSA; V900933, Sigma-Aldrich) 中赖氨酸 (Lys) 残基的自由氨基与甲基丙烯酸酐 (MAA; 276685, Sigma-Aldrich) 反应合成的。将BSA溶于10% (w/v) 的0.25 M碳酸-碳酸氢盐缓冲液中，pH调至9.0。通过调节BSA中MAA与Lys残基的摩尔比[n(MAA):n(Lys)]至0.25:1、0.5:1、1:1、2:1和3:1，合成具有不同取代度的BSA-MA (BSA-MA-0.25、-0.5、-1、-2、-3)。
BSA-MA和BSA-MA-dECM水凝胶的制备与物理化学评价
BSA-MA是通过BSA中Lys残基的自由氨基与MAA反应合成的（图2a）。1H核磁共振 (1H NMR) 波谱确认在BSA-MA-0.25、0.5、1、2和3中存在特征甲基丙烯酰化峰，位于5.4 ppm和5.7 ppm (甲基丙烯酰胺的丙烯质子) 及1.9 ppm (甲基丙烯酰胺的甲基质子)（图2b）。相比之下，3.0 ppm处的特征峰 (未反应Lys的亚甲基质子) 在BSA-MA-2和3中完全消失。
讨论
包括肝细胞移植在内的细胞治疗已被提出作为全器官肝脏移植的替代方案[1]。肝细胞和干/祖细胞通常分别通过门静脉和肝动脉递送[9], [35]。然而，这些方法效率低下，并可能导致严重并发症，包括栓塞和异位细胞播散[9], [35]。LTE通过将细胞与生物材料结合，为原位或异位移植提供了替代方案。
CRediT作者贡献声明
Yao Li: 调查。Zuoyu Liang: 调查。Pengcheng Liu: 验证、方法学。Ying Yang: 方法学。Ji Bao: 写作 – 审查与编辑、监督、资金获取、概念化。Yanyan Zhou: 验证、方法学。Jiayin Yang: 写作 – 审查与编辑、监督、概念化。Hehan Feng: 验证、方法学。Qiong Wu: 写作 – 审查与编辑、监督、资金获取、概念化。Xinglong Zhu: 写作 – 原稿、验证、方法学。
资金
本研究由中国国家自然科学基金资助（82570757、82270662、82273330）。
竞争利益声明
? 作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
Xinglong Zhu | Hehan Feng | Yanyan Zhou | Yang Deng | Li Li | Yi Li | Ying Yang | Pengcheng Liu | Zuoyu Liang | Yao Li | Wanliu Peng | Qiong Wu | Jiayin Yang | Ji Bao
