《SCIENCE ADVANCES》：TET2-driven activation of AGO2 links epigenetic remodeling to myeloid commitment and leukemia
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DNA甲基化（DNAm）动力学塑造造血分化与白血病发生，然而双加氧酶TET2——在髓系恶性肿瘤中频繁突变——如何指导谱系特异性调控程序仍不清楚。在本研究中，研究人员整合了DNA甲基化、染色质可及性、三维（3D）基因组结构、转录谱以及TET2染色质占位数据，以定
DNA甲基化（DNAm）动力学塑造造血分化与白血病发生，然而双加氧酶TET2——在髓系恶性肿瘤中频繁突变——如何指导谱系特异性调控程序仍不清楚。在本研究中，研究人员整合了DNA甲基化、染色质可及性、三维（3D）基因组结构、转录谱以及TET2染色质占位数据，以定义人类髓系定向分化中TET2依赖性的调控程序。研究人员发现，TET2结合的调控区域获得短程和长程染色质相互作用，并且一组独特的远端增强子富集位点经历TET2驱动的去甲基化与激活。其中，研究人员鉴定并功能验证了一个AGO2髓系特异性基因内增强子，该增强子在TET2突变的急性髓系白血病（AML）患者中频繁高度甲基化。AGO2表达可对患者生存进行分层，且AGO2缺失在体内消除白血病植入。这些发现揭示了一条TET2-AGO2调控轴，该轴整合表观遗传重塑、3D基因组重组与白血病适应性，并凸显AGO2作为髓系白血病潜在生物标志物和治疗靶点的价值。
**TET2-AGO2调控轴：表观遗传重塑、三维基因组重构与髓系白血病**
**一、研究背景与问题**
DNA甲基化（DNAm）是哺乳动物基因组最主要的表观遗传修饰，在发育、分化与肿瘤发生中发挥关键作用。DNAm可通过TET（ten-eleven-translocation）双加氧酶家族介导的氧化反应被主动去除：TET酶将5-甲基胞嘧啶（5mC）迭代氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）及后续氧化衍生物，最终恢复为未修饰胞嘧啶。在造血谱系决定过程中，DNAm的转录影响受谱系定向转录因子（TF）甲基化敏感性的调控，例如KLF4、CEBPA等髓系先驱TF可招募TET2至顺式调控元件（CRE），将甲基化不敏感的TF结合与靶向去甲基化联系起来。TET2在整个造血过程中广泛表达，是髓系恶性肿瘤（包括急性髓系白血病（AML）、骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异常综合征）及克隆性造血中最常突变的基因之一。TET2功能缺失导致分化阻滞、髓系偏斜和异常炎症基因表达，然而其直接分子机制仍不清楚，主要原因是长期缺乏在造血分化过程中准确绘制TET2染色质占位的技术手段。
**二、研究开展与主要结论**
为弥补上述空白，研究人员在CEBPA驱动的人类B细胞白血病向功能性巨噬细胞（iMac）诱导分化的模型中，采用CRISPR敲入技术为TET2引入3×Flag标签，结合双交联染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）成功绘制了髓系定向分化早期（72小时）的TET2全基因组占位图谱。通过整合DNAm、染色质可及性（ATAC-seq）、三维（3D）基因组结构（Hi-C）、转录组（RNA-seq）及新生RNA（TT-seq）等多组学数据，研究人员系统解析了TET2依赖性的调控程序。研究发现：TET2结合区域在髓系定向分化中获得增强的短程与长程染色质相互作用；其中一组增强子富集的TET2结合位点（T2-MDPs）发生谱系特异性的DNA去甲基化和染色质激活，包含16个高置信度直接靶标。AGO2表现出最强的甲基化-表达响应：其基因内增强子ER1/ER2在髓系谱系中被选择性去甲基化并功能性地调控AGO2表达。AGO2缺失加速髓系分化、改变炎症与增殖程序，并在两种遗传背景不同的AML患者来源异种移植（PDX）模型中显著损害白血病发展。在AML患者队列中，AGO2位点高甲基化与TET2突变相关，且AGO2表达水平与患者总体生存显著相关。该研究揭示了TET2-AGO2调控轴，将表观遗传重塑、3D基因组重组与白血病维持联系起来，提示AGO2是髓系白血病潜在的生物标志物和治疗靶点。
**三、主要关键技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：①通过CRISPR-Cas9介导的3×Flag标签敲入结合双交联ChIP-seq绘制TET2染色质占位图谱；②整合全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）、ATAC-seq、Hi-C、RNA-seq及TT-seq等多组学数据；③利用短发夹RNA（shRNA）诱导型敲低和CRISPR-Cas9敲除进行功能验证，并通过CRISPR编辑删除候选增强子区域；④采用AML患者来源异种移植（PDX）模型（AML-579和AML-602）进行体内白血病发展评估；⑤使用公开患者队列（TCGA-LAML、BeatAML2、GTEx等）进行临床相关性分析。
**四、研究结果**
**1. Flag标签CRISPR敲入策略能在髓系定向分化中稳健绘制TET2占位图谱**
研究人员通过CRISPR敲入策略生成TET2-3×Flag标记的B细胞系，并诱导其向髓系分化。ChIP-seq分析鉴定了4233个高置信度TET2结合位点（IDR <0.05），富含与髓系定向和巨噬细胞功能相关的基因，且TET2占位主要定位于启动子和远端增强子区域。
**2. TET2结合位点在髓系定向分化中经历三维染色质重组**
将TET2占位数据与Hi-C数据整合分析，研究人员发现TET2结合位点在髓系定向分化中富集长程（5-10 Mb）染色质相互作用，此现象在原代造血干细胞/祖细胞（HSPC）向巨噬细胞分化中也得到验证。TET2结合的增强子-启动子（E-P）环在分化中接触频率增强，且这些环富集于与基因上调相关的短程接触。
**3. 增强子富集的TET2结合位点亚群在髓系定向分化中被特异性去甲基化和激活**
通过ΔDNAm>0.15阈值分类，T2-MDPs（642个位点）表现出显著的DNAm丢失、染色质可及性和活性组蛋白标记增加、以及新生转录获得，而T2-MSPs（3427个位点）在这一过程中基本稳定。
**4. 增强子富集的TET2结合区域在原代人类髓系分化中呈现保守的去甲基化和激活**
原代造血样本分析显示，T2-MDPs在单核细胞和巨噬细胞中呈现谱系特异性去甲基化，在淋巴细胞中保持高甲基化，且超过一半的体外T2-MDPs在体内分化中保守。
**5. TET2缺失破坏髓系定向分化中的谱系特异性DNAm动力学**
利用Dox诱导的TET2敲低（iKD）模型，研究人员发现shTET2细胞在分化过程中出现进行性高甲基化，并于iMac阶段达到1794个差异高甲基化位置，这些位点富集于免疫应答和髓系激活通路。
**6. TET2缺失通过DNA去甲基化缺陷损害髓系特异性基因表达程序的激活**
RNA-seq显示TET2敲低导致分化进程整体延迟，1208个基因在iMac阶段被沉默，包括MAF、IL1B、IRF8等关键髓系调控因子；CRISPR-Cas9敲除克隆进一步验证了IFNGR2、TOM1、AGO2等直接靶基因的下调。
**7. 整合多组学分析揭示AGO2是髓系定向分化中的直接TET2靶标**
将T2-MDPs与TET2敲低后的DMPs和DEGs取交集，获得16个候选基因，其中AGO2显示最强的甲基化-表达依赖性。AGO2基因内增强子ER1/ER2具有增强子活性，缺失任一区域均导致AGO2表达显著下降。
**8. AGO2抑制髓系分化，同时支持炎症与增殖程序**
AGO2敲低加速了髓系标志物（CD19丢失、CD11b获得）的转变，并导致更成熟的分化表型（CD206等上调），同时下调核糖体、翻译和细胞周期程序，上调炎症相关通路；在LPS等刺激下，AGO2缺失细胞表现出减弱的细胞因子响应。
**9. AGO2位点甲基化状态预测AML中的表达与预后**
在TCGA-LAML队列中，TET2突变样本的AGO2 cg00288598位点显著高甲基化；基于AGO2位点甲基化状态的无监督聚类将患者分为低甲基化（A1）和高甲基化（A2）两组，TET2突变样本全部归入A2，且A2组AGO2表达较低、生存较差。
**10. AGO2表达水平与AML转录程序及患者结局相关**
AGO2在AML中整体升高，高表达患者预后显著较差，并与红细胞系相关调控因子（TAL1、EPOR）表达增加及M6/M7 FAB亚型富集相关；AGO2表达与cg00288598甲基化呈非线性关系，多数表达增益发生在高度至中度甲基化转变阶段。
**11. AGO2缺失在遗传背景不同的AML-PDX模型中损害白血病发展**
在两种独立AML-PDX模型中，AGO2敲低显著降低白血病负荷、减少骨髓和器官浸润，并延长小鼠生存，而凋亡检测未发现显著差异，表明AGO2主要通过损害白血病维持而非增加细胞死亡发挥作用。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，通过Flag标签纯化揭示了此前未表征的髓系定向中间阶段的TET2占位图谱，表明TET2在分化早期即被招募。TET2结合位点富集于调控元件，且TET2结合启动子在全造血系统中基本无甲基化，提示TET2存在不依赖于去甲基化的功能，可能通过生物分子凝聚以及与CEBPA协同作用塑造染色质结构。T2-MDPs代表真正的TET2调控增强子，其激活直接贡献于谱系特异性转录程序。AGO2在正常和恶性造血中均参与分化与自我更新的平衡，其缺失削弱AML维持的机制可能与RNA诱导沉默复合体（RISC）功能及P-body介导的mRNA隔离等非经典功能有关。AML分析中观察到AGO2高甲基化与高表达均与不良预后相关，提示二者捕获了AML生物学中不同特征：高甲基化与TET2/IDH突变相关，高表达则界定具有红系/巨核系特征的不同AML亚群。
研究结论为：该研究揭示了TET2依赖性的AGO2位点调控机制，谱系特异性增强子去甲基化精细调节AGO2表达，以协调髓系分化、炎症响应和增殖能力，而该调控轴的破坏可能促进白血病进展。这些发现将AGO2定位为AML的潜在治疗靶点，可通过直接药理学抑制或与DNA低甲基化药物联合使用，在抑制白血病生长的同时促进分化相关程序，为AML治疗提供了新策略。
