烟酸磷酸核糖转移酶（NAPRT）调控三阴性乳腺癌侵袭性、Ca2+稳态及NAD+衍生的Ca2+动员第二信使

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Nicotinate Phosphoribosyltransferase controls aggressiveness, Ca2+ homeostasis, and NAD+-derived Ca2+ mobilizing second messengers in triple-negative breast cancer

　　

烟酸磷酸核糖转移酶（nicotinate phosphoribosyltransferase, NAPRT）扩增与三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）患者的不良预后和复发相关。NAPRT影响TNBC细胞在二维/三维培养条件下的增殖、迁移和侵袭能力。NAPRT通过改变烟酸腺嘌呤二核苷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide, NAADP⁺）和环ADP-核糖（cyclic ADP-ribose, cADPR）水平调控Ca²⁺稳态。研究人员开发了一种新的NAADP⁺定量检测方法。

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）缺乏雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）基因扩增，对内分泌治疗和HER2靶向治疗不敏感，且转移和复发风险高、预后差，因此发现新治疗策略十分必要。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺）是代谢稳态所需的重要辅酶，肿瘤细胞常通过烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）等通路维持NAD⁺供应；但NAMPT抑制剂存在毒性及肿瘤细胞利用替代NAD⁺合成途径等问题。烟酸磷酸核糖转移酶（nicotinate phosphoribosyltransferase, NAPRT）是Preiss-Handler通路的限速酶，参与多种肿瘤对NAMPT抑制剂及DNA损伤药物的抵抗，但其与TNBC侵袭性及NAD⁺衍生Ca²⁺动员第二信使之间的联系尚不清楚。研究人员因此探讨NAPRT表达与TNBC侵袭性及Ca²⁺信号之间的关系，并提出抑制NAPRT可能成为TNBC治疗新策略。

研究方法方面，研究人员使用MDA-MB-231、MDA-MB-468和4T1等TNBC细胞及NAPRT沉默/过表达工程细胞，通过Western blot验证表达，采用细胞活力、增殖、衰老、划痕愈合、趋化运动和三维球体胶原侵袭实验评估表型；用qPCR和ELISA检测炎症因子；采用健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs，n=3，2女1男）进行趋化、流式细胞术及球体浸润实验；以Fura-2测定[Ca²⁺]_i；以循环酶法、HPLC及新开发的NAADP⁺定量法检测NAD⁺相关代谢物和酶活性；并结合TCGA PanCancer Atlas中TNBC 109例样本的拷贝数数据及KM Plotter中TNBC队列（总生存n=144，无复发生存n=442）进行生物信息学分析。

结果部分，3.1 NAPRT表达与TNBC不良预后相关：cBioPortal分析显示NAPRT基因在乳腺癌中至少10%发生改变，主要为扩增，扩增肿瘤中NAPRT mRNA显著上调；正常乳腺组织NAPRT蛋白低或不可测；KM Plotter显示NAPRT高表达患者总生存和无复发生存降低、复发概率增加，提示NAPRT扩增/高表达与TNBC侵袭性和不良预后相关。3.2 NAPRT沉默/抑制使TNBC细胞对NAMPT抑制剂敏感：NAPRT沉默本身未改变NAD⁺，但FK866处理后NAD⁺下降更明显、细胞活力降低；FK866与2-HNA联合在原生MDA-MB-231中显著降低NAD⁺和活力，而在NAPRT缺陷的MDA-MB-468中作用不明显；NAPRT沉默减慢增殖，过表达加快增殖，且未检测到衰老细胞，提示TNBC依赖NAMPT维持NAD⁺，NAPRT参与NAMPT抑制后的代偿并促进增殖。3.3 NAPRT表达影响TNBC细胞迁移和侵袭：划痕实验显示NAPRT沉默或药物抑制降低迁移，过表达加速愈合；趋化运动实验显示沉默降低、过表达增强MDA-MB-231、MDA-MB-468和4T1细胞迁移；三维球体实验显示过表达增加侵袭、沉默减少侵袭，提示NAPRT增强TNBC迁移和侵袭。3.4 NAPRT缺失促进促炎分子产生和免疫细胞浸润：qPCR显示沉默细胞ZEB1降低、IL-6和TNFα增加；ELISA显示沉默细胞基础IL-6释放增加，TNFα刺激原生细胞增加IL-6释放；PBMC趋化实验显示沉默细胞条件培养基吸引更多免疫细胞，流式分析显示CD3⁺CD4^-CD8^-γδ和CD3⁺CD8⁺ T细胞呈增加趋势；球体共培养显示NAPRT过表达降低PBMC浸润、沉默增加浸润，提示NAPRT下调可增强免疫细胞募集。3.4.1 NAPRT表达影响Ca²⁺稳态：Fura-2检测显示NAPRT沉默细胞基础[Ca²⁺]_i较低、内质网Ca²⁺补充增强，过表达细胞基础[Ca²⁺]_i较高、内质网Ca²⁺储备减少；FBS刺激后沉默细胞[Ca²⁺]_i升高更明显；MDA-MB-468和4T1过表达细胞呈一致变化，提示NAPRT调控Ca²⁺稳态。3.5 NAPRT表达调节细胞内cADPR和NAADP⁺水平：NAPRT过表达细胞cADPR较高、沉默细胞较低；胞质和膜组分ADP-核糖环化酶活性在过表达细胞升高、沉默细胞降低；NAADP⁺在过表达细胞显著升高，沉默细胞呈下降趋势；沉默细胞NAM降低，过表达细胞NMN升高、沉默细胞NMN降低，提示NAPRT影响NAD⁺相关代谢物及Ca²⁺动员第二信使。3.5.1 CD38和SARM1活性介导NAPRT诱导效应：使用CD38抑制剂78c或SARM1抑制剂DSRM-3716处理NAPRT过表达细胞，可完全逆转MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的Ca²⁺稳态改变，两者均降低趋化运动，78c抑制球体基质侵袭，提示CD38和SARM1活性参与介导NAPRT效应。

讨论与结论部分，研究人员总结认为，在NAPRT下调的肿瘤中NAMPT抑制剂可显著耗竭NAD⁺并影响存活，而NAPRT在包括TNBC在内的部分恶性肿瘤中常扩增和过表达，沉默NAPRT可增敏NAMPT抑制，联合抑制NAMPT与NAPRT可能成为利用肿瘤易感性的治疗策略。该研究首次显示NAPRT表达可调节TNBC侵袭性，并影响细胞内Ca²⁺流及下游通路，提示NAPRT可能通过不依赖NAD⁺合成的机制促进侵袭性；NAPRT增强迁移和侵袭，沉默后TNFα和IL-6升高，提示NAPRT可能负向调节这些促炎因子，并可能在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，抑制NAPRT可能促进免疫细胞浸润。研究显示NAPRT沉默细胞[Ca²⁺]_i较低且内质网补充增加，过表达细胞相反；cADPR可作用于内质网Ryanodine敏感受体，NAADP⁺可作用于Ryanodine敏感受体和酸性细胞器上的双孔通道，NAPRT可能通过调节cADPR和NAADP⁺产生影响Ca²⁺稳态；CD38/SARM1活性及NMN等中间代谢物变化可能参与其中。结论翻译如下：本研究强调NAPRT表达对TNBC的影响，提示其作为治疗靶点的潜力。目前，NAPRT在非TNBC乳腺癌细胞中的作用仍有待明确。抑制NAPRT，无论作为单药还是与NAMPT抑制剂联合，均可能为对当前治疗耐药的肿瘤提供新机会，并提高抗癌治疗的总体疗效。鉴于NAPRT在癌症中作用的新证据，多个研究团队正在开发新的抑制剂。已有少数NAPRT抑制剂在体内进行了测试，但在应用于人类前仍需进一步优化。未来研究应聚焦于开发特异、安全且有效的NAPRT抑制剂，并详细评估其与NAMPT靶向治疗联合使用的疗效。