scEM-seq：基于液滴微流控的单细胞酶法DNA甲基化组高通量测序实现表观遗传异质性解析

《SCIENCE ADVANCES》：High-throughput droplet-based enzymatic DNA methylome profiling enables single-cell resolution of epigenetic heterogeneity

DNA甲基化（DNA methylation）是调控基因表达、细胞身份和疾病相关调控程序的基本表观遗传修饰。然而，高通量单细胞DNA甲基化（single-cell DNA methylation）技术受限于DNA降解、CpG回收率低以及基于亚硫酸氢盐（bisulfite）方法的可扩展性差。在此，研究人员提出scEM-seq，一种基于液滴的单细胞酶法甲基化组测序（droplet-based single-cell enzymatic methylome sequencing）方法，该方法在单次乳化步骤中整合条形码连接（barcode ligation），随后进行乳化后胞嘧啶至尿嘧啶转化（postemulsion cytosine-to-uracil conversion）。该设计大幅减少DNA损失，并能够在每次实验中稳健分析数万个单细胞。与其他基于液滴的微流控方法相比，scEM-seq可生成高质量单细胞甲基化组（single-cell methylomes），具有适度提高的CpG覆盖度和均衡的读段利用（read utilization）。应用于外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）时，scEM-seq可准确解析主要免疫谱系；在前列腺癌（prostate cancer）组织中，它揭示多样的恶性细胞状态以及患者特异性的表观遗传和拷贝数架构（copy number architectures）。scEM-seq能够在多种生物学和疾病背景下实现可扩展的单细胞表观遗传异质性解析，拓宽了基于DNA甲基化的研究在细胞调控和疾病中的应用范围。

研究背景：DNA甲基化，尤其是胞嘧啶C⁵位甲基化，是调控全基因组基因表达的重要表观遗传修饰，并与胚胎发生中的细胞来源身份、细胞分化及多种疾病进展密切相关。全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）是单碱基分辨率检测DNA甲基化的金标准，但批量WGBS无法解析复杂组织尤其是肿瘤中的细胞类型特异性DNA甲基化模式。单细胞WGBS技术主要包括低通量微孔法、高通量组合索引法和液滴微流控法；组合索引法依赖多轮索引和混合，可能引入操作变异；液滴法可物理分隔单细胞并改善反应控制，但现有scTAM-seq仅检测约650个CpG/细胞，Drop-BS-seq有效读段利用和CpG回收受限，且现有方法缺乏针对稀疏单细胞甲基化数据的集成分析框架。因此，研究人员开展scEM-seq研究，以克服DNA降解、低CpG回收和可扩展性不足等问题，并推动单细胞DNA甲基化在免疫、肿瘤等复杂系统中的高分辨率应用。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。研究意义在于提供可扩展、易获取、高性能的单细胞全基因组DNA甲基化谱分析平台，并可支持拷贝数变异推断和临床肿瘤异质性解析。

主要技术方法：研究人员对细胞/细胞核固定、去除核小体并行Tn5转座酶片段化；在商业液滴微流控平台中与条形码凝胶珠共包裹，经桥接寡核苷酸在单次乳化内完成细胞条形码和UMI（unique molecular identifiers）连接；破乳后行酶法C→U转化、扩增、Tn5-B片段化和索引PCR，构建PE150文库。分析包括条形码拆分、Bismark比对、UMI去重、甲基化提取、双/多细胞检测、MethSCAn/Seurat聚类、scMethID注释、伪批量DMR、fCpG进化及ichorCNA拷贝数分析。样本为22Rv1/PC3细胞2D/3D及混合样本、2例健康PBMC、2例原发前列腺癌组织（PCa1 Gleason 7，PCa2 Gleason 8），并采用TCGA-PRAD、BLUEPRINT、sciMET-cap及泛组织参考数据比较。

研究结果：Development of scEM-seq：研究人员通过22Rv1和PC3细胞2D/3D培养及混合样本、人PBMC与小鼠脑核物种混合实验建立并评估流程；获得3,812个高质量单细胞甲基化组，平均每个细胞检测85,348个CpG，平均唯一比对效率约64%；全基因组甲基化模式与WGBS一致，表现为CpG岛低甲基化和蛋白编码基因启动子甲基化降低；在匹配测序输出下，scEM-seq较Drop-BS-seq多检测11.3%的CpG，且读段1和读段2比对更均衡；可区分2D与3D培养细胞及1:2混合比例；物种混合实验估计跨物种多细胞率为8.7%，单细胞条形码中交叉污染低。结论是scEM-seq可生成高质量、可扩展且重复性好的单细胞甲基化组。scEM-seq resolves cell identity and epigenetic state in cultured cell lines：研究人员将混合细胞与已知身份的2D/3D细胞联合进行UMAP降维和Louvain聚类，细胞按身份而非培养条件分群；22Rv1和PC3各自形成三群，分别对应3D来源、2D来源及中间表观状态；差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）和多样本同质甲基化区块分析显示细胞骨架组织、细胞极性和信号转导相关通路；CTCF结合区甲基化呈条件特异性差异，而蛋白编码基因和CpG岛甲基化变化较小。结论是scEM-seq可敏感解析细胞身份及细微的状态依赖表观遗传变异。scEM-seq performance on PBMCs：研究人员对2例健康人PBMC进行scEM-seq，共获得9,551个细胞，平均每个细胞检测69,569个CpG；经MethSCAn和Seurat分析得到6个簇，注释为T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞、NKT细胞、B细胞和单核细胞；利用BLUEPRINT低甲基化区域及标记基因启动子相关mblock验证注释；识别细胞类型特异性DMR及B细胞活化、髓系白细胞分化、T细胞分化等GO通路；B细胞和NKT细胞具有较高比例的低甲基化DMR及整体降低的基因体、CpG岛和CTCF结合区甲基化；与sciMET-cap定义的B细胞高/低甲基化DMR呈正相关，且全基因组设计提供更广的DMR发现空间。结论是scEM-seq可准确解析主要免疫谱系及其表观遗传特征。scEM-seq detects epigenetic intratumor heterogeneity in prostate cancer：研究人员对2例原发前列腺癌组织进行分析，保留9,364个细胞，平均比对效率约69%，汇总约2,860万个CpG，覆盖超过95%的hg38基因组CpG；整体甲基化分布与队列批量WGBS一致；初始聚类得到13个簇，肿瘤簇整体DNA甲基化降低并伴大规模低甲基化区域；亚聚类获得TC0–TC6和NC0–NC14，采用scMethID整合单细胞RNA测序、批量WGBS和批量RNA测序进行注释，识别上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、髓系细胞和T细胞；肿瘤上皮细胞呈现明显患者特异性 segregation；TC0和TC1特异性低甲基化DMR在TCGA-PRAD队列中与更高的生化复发（biochemical recurrence, BCR）发生率、侵袭性Gleason评分（Gleason score, GS）8–10及更差无进展生存相关；GO富集显示羧酸代谢、酰胺代谢和脂肪酸代谢等通路；基于波动CpG（fluctuating CpGs, fCpGs）的进化树显示TC0和TC1位于终末或更远端分支；拷贝数变异（copy number variation, CNV）分析显示患者内相似、患者间差异，TC0和TC1结构改变负荷较高，甲基化改变富集于CNV改变区域，PCa1中TC0、TC2和TC6甲基化与CNV正相关而PCa2未见该关系，CNV跨部分甲基化结构域（partially methylated domains, PMDs）、未甲基化区域（unmethylated regions, UMRs）和DNA甲基化谷（DNA methylation valleys, DMVs），并在TC1和TC3中富集于DMV。结论是scEM-seq可在单细胞分辨率解析前列腺癌表观遗传异质性、临床相关恶性状态及CNV与表观遗传的耦合。

讨论部分总结：scEM-seq填补了在商业液滴系统中开展高通量全基因组甲基化分析的技术空白；通过去除亚硫酸氢盐转化和多步乳化，减少DNA断裂与损失，较其他液滴微流控方法提高每细胞CpG回收和数据质量，但其每细胞CpG覆盖仍低于scBS-seq和snmC-seq2等低通量/高覆盖方法；兼容标准商业液滴仪器，降低多步或定制微流控流程的操作门槛；除DNA甲基化外，还可从单细胞甲基化组推断CNV，扩展至肿瘤亚克隆异质性和临床样本遗传/表观轨迹研究；估计试剂成本约$0.024/细胞，低于Drop-BS的$0.05–0.08/细胞、snmC-seq2约$5.6/核及sciMET-v2约$0.23/核。局限包括：每细胞覆盖相对批量WGBS仍稀疏，检测低频表观遗传事件可能需要更深测序；高度异质性肿瘤中的广泛CNV可能通过影响非二元甲基化率（nonbinary methylation rate, NBMR）和读段计数衰减指数（read count decay index, D_i）而干扰双/多细胞检测；当前仅分析DNA甲基化，尚未在同一细胞微流控平台联合检测染色质可及性和转录组状态，而板式scNMT-seq和scTrio-seq已实现多模态测量；未来整合多组学策略可提升分辨率和可解释性。

研究结论翻译：总之，scEM-seq为单细胞DNA甲基化谱分析提供了一种可扩展、易获取且高性能的解决方案，克服了现有通量和依赖亚硫酸氢盐方法的关键限制，从而能够在多种生物学和临床背景中高分辨率解析表观遗传异质性，如在外周血单个核细胞和前列腺癌组织中所展示。它可能为解析发育、免疫、癌症及其他复杂生物系统中的表观遗传异质性开辟新途径。