《Infection and Drug Resistance》：Antibacterial Activity, Biofilm Inhibition, and Modulation of Virulence-Associated Gene Expression by Probiotic-Derived Cell-Free Supernatants Against Multidrug-Resistant Serratia marcescens
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背景：多重耐药（MDR）粘质沙雷菌（Serratia marcescens）是一种重要的机会致病菌，与持续性医疗相关感染相关，部分原因在于其形成生物膜和表达毒力相关因子的能力。益生菌源无细胞上清液（cell-free supernatants, CFSs）含有
背景：多重耐药（MDR）粘质沙雷菌（Serratia marcescens）是一种重要的机会致病菌，与持续性医疗相关感染相关，部分原因在于其形成生物膜和表达毒力相关因子的能力。益生菌源无细胞上清液（cell-free supernatants, CFSs）含有分泌型代谢物，可能为控制耐药细菌提供非抗生素途径。然而，针对粘质沙雷菌的细菌源和酵母源CFSs的比较数据仍有限。方法：研究人员从Lacticaseibacillus rhamnosus GG、Bacillus coagulans、Bifidobacterium longum和Saccharomyces boulardii制备CFSs，并通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS）检查代谢物谱。采用纸片扩散法和肉汤微量稀释法评估抗菌活性；在1/2和1/4最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）下采用结晶紫染色评估生物膜形成抑制；通过定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测fimA、bsmA和shlA表达，并通过MTT法评估HEK293细胞活力。结果：四种CFSs均以浓度依赖方式抑制粘质沙雷菌生长。L. rhamnosus GG显示最强活性，MIC/最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）为0.375/0.75 mg/mL，在12 mg/mL时抑菌圈为26 mm。在1/2 MIC下，生物膜形成抑制率分别为71%、57%、47%和32%。四种CFSs均显著降低fimA和bsmA表达，而shlA表达被L. rhamnosus GG、B. coagulans和B. longum显著降低，但未被S. boulardii显著降低。在测试条件下，HEK293细胞活力保持在80%以上。结论：益生菌源CFSs表现出抗菌和生物膜形成抑制活性，并与粘质沙雷菌中所选毒力相关基因表达降低相关。L. rhamnosus GG源CFSs显示最强总体活性，支持进一步的机制和体内研究。
一、研究背景与目的。多重耐药（MDR）粘质沙雷菌是肠杆菌科革兰阴性兼性厌氧机会致病菌，可导致肺炎、尿路感染、菌血症、伤口感染和器械相关感染，尤其在免疫受损和危重患者中。其可在导尿管、中心静脉导管和气管插管等留置医疗器械上定植，是重症监护病房和新生儿病房的持续问题。产超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶MDR菌株的出现减少了治疗选择。生物膜形成是其主要致病要素，生物膜内细菌基因表达和代谢活性改变，常降低抗生素敏感性；同时其群集运动、群体感应网络及溶血素、serralysin金属蛋白酶和脂肪酶等分泌型毒力因子参与持续存在和致病性。fimA与菌毛功能及生物膜相关表型有关，bsmA为生物膜相关基因，shlA编码主要ShlA溶血素。传统抗生素对生物膜内MDR粘质沙雷菌失败增加，促使研究人员关注针对致病机制而非单纯杀灭细菌的抗生物膜和抗毒力策略。益生菌源CFSs含有机酸、细菌素、短链脂肪酸和生物表面活性剂等，可能干扰群体感应信号并调节毒力相关基因表达；与活益生菌相比，CFSs可避免给予活微生物，并可能具有稳定性和安全性优势。但评价其抗MDR革兰阴性病原体尤其粘质沙雷菌的比较研究有限，因此本研究旨在比较L. rhamnosus、B. longum、B. coagulans和S. boulardii来源CFSs对MDR粘质沙雷菌的抗菌活性、生物膜形成抑制及所选毒力相关基因表达的影响。
二、研究概况与意义。研究人员以MDR粘质沙雷菌为对象，比较四种益生菌源CFSs的抗菌、抗生物膜和毒力相关基因表达调控作用，并评估HEK293细胞活力。结论为：细菌源和酵母源CFSs均具有抗菌和生物膜形成抑制活性，并与所选毒力相关基因表达降低相关；L. rhamnosus GG总体活性最强；GC–MS显示菌株特异性代谢物组成，可能与活性差异有关，但未确定单个代谢物贡献；所有制备物在测试条件下维持HEK293细胞活力80%以上，与有限细胞毒性一致。该研究为CFSs作为控制MDR粘质沙雷菌的补充策略提供了比较性体外证据，并支持进一步机制和体内研究；临床转化前需以临床MDR分离株、纯化组分和体内感染模型验证。
三、关键技术方法。研究人员以MDR粘质沙雷菌ATCC 13880为参照致病株，以L. rhamnosus GG ATCC 53103、B. longum ATCC 15707、B. coagulans MTCC 5856和S. boulardii CNCM I-745制备CFSs；采用GC–MS分析代谢物谱，纸片扩散法和肉汤微量稀释法评估抗菌活性并测定MIC/MBC，结晶紫微孔板法评估生物膜形成抑制，qRT-PCR检测fimA、bsmA和shlA表达，MTT法检测HEK293细胞活力；HEK293细胞来源于Razi Vaccine and Serum Research Institute（Iran）。
四、研究结果。1. 无细胞上清液的GC–MS代谢物谱分析：通过GC–MS检测L. rhamnosus GG ATCC 53103、B. coagulans MTCC 5856、B. longum ATCC 15707和S. boulardii CNCM I-745的CFSs，发现供试益生菌菌株具有不同代谢物谱，四种CFSs检测到的代谢物类型存在差异。2. 抗菌药物敏感性评估：通过Kirby–Bauer纸片扩散法和CLSI方案评估，MDR粘质沙雷菌对碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑等多数受试抗菌药耐药，符合多类抗菌药非敏感MDR标准；对氨基糖苷类和替加环素呈可变敏感性。3. 抑菌圈形成：纸片扩散法显示所有CFSs对MDR粘质沙雷菌呈浓度依赖性抗菌活性，抑菌圈直径随浓度增加而增大；L. rhamnosus最强，其次为B. coagulans、B. longum和S. boulardii；在3和1.5 mg/mL时活性下降，但所有CFSs仍保留可测抑制活性。4. MIC与MBC测定：肉汤微量稀释法和亚培养显示所有CFSs均有抗菌活性；L. rhamnosus MIC 0.375 mg/mL、MBC 0.75 mg/mL；B. coagulans和B. longum均为MIC 0.75 mg/mL、MBC 1.5 mg/mL；S. boulardii活性最低，MIC 1.5 mg/mL、MBC 3 mg/mL。5. CFSs对生物膜形成的抑制作用：结晶紫微孔板法显示所有CFSs较未处理对照显著降低生物膜形成（P<0.05），1/2 MIC抑制高于1/4 MIC；L. rhamnosus在1/2 MIC（0.1875 mg/mL）抑制71%，1/4 MIC（0.09375 mg/mL）为60%；B. coagulans为57%和43%；B. longum为47%和34%；S. boulardii最低，为32%和21%。6. 毒力相关基因表达分析：qRT-PCR显示，与未处理对照相比，所有CFSs显著降低fimA和bsmA表达；shlA在L. rhamnosus、B. coagulans和B. longum处理后显著降低，S. boulardii处理后降低不显著；所研究基因中fimA相对表达降幅最大，其次为bsmA和shlA。7. 细胞活力测定：MTT法显示48 h暴露后所有CFSs和浓度下HEK293细胞活力保持80%以上；与未处理对照相比，1/4 MIC或1/2 MIC未观察到显著细胞活力降低；在MIC下，L. rhamnosus、B. coagulans和S. boulardii处理显著降低细胞活力（P<0.05），B. longum降低不显著；总体上测试CFSs在受试体外条件下细胞毒性有限。
五、讨论总结与研究结论翻译。讨论指出，MDR粘质沙雷菌因内在和获得性耐药、强生物膜形成及留置器械持续存在而成为治疗挑战；其成熟生物膜及黏附素、溶血素、分泌系统和群体感应网络的协调表达导致治疗失败和复发性医疗相关感染。本研究中细菌源和酵母源CFSs表现抗菌和生物膜形成抑制活性，并与所选毒力相关基因表达降低相关，同时对HEK293细胞细胞毒性有限；L. rhamnosus一致显示最强抑制活性，可能与CFSs代谢物组成差异有关。该抗菌活性与既往关于益生菌源CFSs抗MDR革兰阴性病原体的报道一致，如Drumond等报道乳酸菌CFSs抑制Pseudomonas aeruginosa生长和生物膜，Ozma等报道乳酸菌CFSs抑制MDR Escherichia coli且细胞毒性低；本研究将观察扩展至MDR粘质沙雷菌。生物膜抑制是临床相关发现，因为生物膜形成是粘质沙雷菌慢性定植、器械相关感染和抗菌耐受的主要决定因素；既往非抗生素抗毒力化合物研究如Shaikh等报道ebselen抑制粘质沙雷菌浮游生长和生物膜，Khayat等报道亚抑制浓度柠檬酸钠降低生物膜形成并下调多个毒力决定因子；本研究中CFSs可能影响黏附和胞外聚合物产生相关过程，但未评估其对群体感应通路的直接作用。fimA、bsmA和shlA表达降低是重要发现；fimA编码I型菌毛主要结构亚基，介导初始黏附；bsmA参与生物膜成熟和胞外生物膜结构稳定；shlA编码成孔溶血素，参与上皮损伤、宿主细胞毒性和免疫逃逸。CFSs可能影响多个毒力相关性状而非单一表型，但其对细菌适应性和耐药发展的影响未评估；本研究未确定具体机制。Li等报道海洋真菌Cladosporium sphaerospermum来源代谢物显著降低fimA、fimC、bsmA、bsmB和shlA转录并抑制胞外多糖、泳动、蛋白酶和生物膜，提示黏附和其他毒力相关过程调节可能参与观察到的效果。HEK293细胞活力在测试条件下保持80%以上，MIC下L. rhamnosus、B. coagulans和S. boulardii出现显著降低，提供初步体外细胞毒性证据；这与既往益生菌源CFSs细胞毒性较低的报道一致。S. boulardii CFS抗菌和生物膜抑制活性低于L. rhamnosus和B. coagulans，但仍产生可测抑制并与所研究毒力相关基因表达降低相关，唯shlA降低不显著；差异可能部分与细菌源和酵母源制备物代谢物组成不同有关。局限性包括：仅使用单一粘质沙雷菌菌株，可能限制对其他临床或MDR分离株的推广；实验均为体外，需体内模型验证；生物膜生物量未按细菌生长归一化，限制生物膜抑制效果解释；仅分析三个毒力相关基因，未进行直接评估相应毒力表型的功能实验；细胞毒性仅用HEK293细胞系，需其他相关哺乳动物细胞模型进一步评价安全性。研究结论翻译：L. rhamnosus GG、B. longum、B. coagulans和S. boulardii的细菌源和酵母源制备物对MDR粘质沙雷菌表现出抗菌和生物膜形成抑制活性，并与所选毒力相关基因表达降低相关。L. rhamnosus GG在抗菌和生物膜形成抑制方面表现出最高总体活性。GC–MS谱分析揭示了菌株特异性代谢物组成，这可能与活性差异有关，但未确定单个代谢物的贡献。所有制备物在测试条件下维持HEK293细胞活力80%以上，与在该体外模型中细胞毒性有限一致。总之，这些结果提示这些制备物可能是进一步机制和体内研究的有希望候选者。临床转化必须首先以临床MDR分离株、纯化组分和体内感染模型进行验证。
