《Methods and Protocols》：Beyond the Limits: Sequencing A/H5N1 from Animal Tissues with Low Viral Loads
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摘要专业翻译
近期报告显示，伴侣动物和野生动物中A/H5N1感染数量持续增长，尤其在欧洲和美国，以及最近在澳大利亚，该病毒对包括受威胁物种在内的本地野生动物构成潜在严重威胁。在波兰，继2023年夏季发生动物流行病后，A/H5N1病毒持续在家养动物中被检出并呈现
摘要专业翻译
近期报告显示，伴侣动物和野生动物中A/H5N1感染数量持续增长，尤其在欧洲和美国，以及最近在澳大利亚，该病毒对包括受威胁物种在内的本地野生动物构成潜在严重威胁。在波兰，继2023年夏季发生动物流行病后，A/H5N1病毒持续在家养动物中被检出并呈现临床症状。哺乳动物感染的持续发生凸显了对可靠诊断方法的需求。研究人员的经验表明，即使在具有严重临床症状且病程快速进展、常致死亡的动物中，A/H5N1感染的诊断仍具挑战性。在部分临床和尸检样本中，低病毒RNA载量和/或组织来源的PCR抑制剂可妨碍扩增及后续测序。然而，截至2026年年中，研究人员已在犬、猫和雪貂中鉴定出超过40例A/H5N1感染，凸显了在哺乳动物病例中持续需要高灵敏度的分子诊断方法。优化后的工作流程能够实现对血凝素（H5）和神经氨酸酶（N1）扩增子的稳健下游靶向Sanger测序，为亚型确认和靶向遗传表征提供了一种快速诊断补救方案。通过优化低病毒载量样本的诊断工作流程，该方案能够在伴侣动物中实现高致病性禽流感（HPAI）H5N1亚型的分子诊断确认。
论文解读
一、研究背景与意义
高致病性禽流感（HPAI）A/H5N1病毒（属于正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒，可导致家禽和哺乳动物严重全身性感染）长期以来主要与禽类宿主相关，但近年来其宿主范围显著扩展。该病毒2.3.4.4b分支（依据血凝素基因系统发育分类的病毒亚分支，自2021年10月以来在全球范围内快速传播）已跨越传统物种屏障，在欧洲、北美、南美及亚洲多地造成野生和家养哺乳动物的大量感染和死亡。2023年6月至7月，波兰经历了前所未有的家猫HPAI A(H5N1)疫情暴发，随后在犬和宠物雪貂中也有散发病例检出，标志着该病毒流行病学格局的重大转变。世界卫生组织（WHO）在2023年7月的疾病暴发新闻中承认了波兰猫科动物疫情的异常性质，强调了其人畜共患意义。在南美洲，该病毒导致秘鲁、智利和阿根廷的海狮及毛皮海狮大规模死亡，并鉴定出PB2基因（编码聚合酶碱性蛋白2，是流感病毒聚合酶复合体的关键亚基，其特定氨基酸替换可增强病毒在哺乳动物中的聚合酶活性和毒力）中的哺乳动物适应性相关替换Q591K和D701N。在韩国，2023年动物收容所的猫感染该病毒后发生致死性感染，分离病毒携带PB2-E627K或D701N替换。在美国，2022年4月至7月间，10个州的67只野生陆生哺乳动物被检出感染，以神经症状为主要临床表现，组织病理学发现包括坏死性脑膜脑炎、间质性肺炎和心肌坏死。2024年初，美国多个州的泌乳奶牛中检出该病毒，主要临床表现为产奶量骤降伴中性粒细胞性乳腺炎，食用受感染奶牛生乳或初乳的家猫发生致死性全身性感染。尤其令人担忧的是该病毒可能传入澳大利亚，对其独特的本地动物群构成严重威胁。
尽管受感染动物临床疾病严重，但实验室检测和病毒遗传表征仍具挑战性。主要障碍之一是诊断组织中的低病毒载量，表现为RT-qPCR（逆转录实时荧光定量聚合酶链反应，用于检测和定量病毒RNA的分子诊断方法）检测中的高Ct值（循环阈值，即荧光信号超过背景阈值所需的扩增循环数，Ct值越高表示初始病毒核酸量越低）。在此类病例中，包括直接全基因组下一代测序（NGS，高通量并行测序技术，可同时对大量DNA/RNA分子进行测序）在内的标准工作流程可能因模板量不足、RNA质量差以及共纯化的PCR抑制剂而失败。及时测序和公开共享哺乳动物宿主中检出的A/H5N1病毒基因组数据，对于监测病毒进化、识别潜在适应性突变和评估人畜共患风险至关重要。已有研究证明，在低病毒载量下，Sanger测序（基于链终止法的经典一代测序技术，适用于短片段靶向测序）优于NGS：在SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型）感染者唾液样本中，病毒滴度低于103拷贝/mL时，Sanger测序的扩增成功率达89.7%，而Illumina NextSeq 2000测序仅为19.2%。
本研究的创新之处不在于任何单一组分——RNA浓缩试剂盒和增加模板体积均为已有技术——而在于将其系统性组合并针对特定高难度诊断情境进行验证：即RT-qPCR Ct值无法支持全基因组测序的HPAI H5N1阳性伴侣动物尸检组织。据研究人员所知，尚无已发表的方案描述针对低病毒载量兽医样本的HPAI亚型确认的这种组合方法。
二、研究设计与技术方法
本研究旨在实现从低病毒载量（操作上定义为RT-qPCR阳性且Ct值>25）的临床组织样本中对A/H5N1病毒RNA进行可靠测序。研究采用模块化工作流程设计，包含三个主要阶段：RNA提取与浓缩、逆转录PCR扩增、PCR扩增子Sanger测序及序列分析。关键技术方法包括：（1）将组织分为三个10 mg平行等分样本（共30 mg）进行独立RNA提取，以提高裂解缓冲液对组织的裂解效率并增大有效表面积与体积比；（2）使用Clean Up RNA Concentrator试剂盒对三个独立洗脱液分别进行纯化和浓缩（各从80 μL浓缩至15 μL），随后合并为45 μL总洗脱液；（3）在20 μL一步法RT-qPCR反应体系中，省略无核酸酶水组分，将RNA模板体积从标准4 μL增加至7.6 μL，以最大化反应中病毒RNA的输入量；（4）使用H5和N1特异性引物探针组进行靶向扩增，扩增产物经72 °C终延伸5分钟后用于Sanger测序。样本来源为2023年7月至11月间采集的七个脑或肺组织样本（编号G-3、G-10、G-13、G-17、G-21、G-37、G-42），来自经RT-qPCR预先确认A/H5N1感染的伴侣动物（犬、猫、雪貂），其中五个样本（G-10、G-13、G-17、G-21、G-37）此前已尝试全基因组NGS但未能获得足够的病毒序列信息。该方案还额外在两只动物的咽拭子样本上进行了验证。
三、研究结果
3.1 全基因组NGS的失败与优化工作流程的成功
在实施优化工作流程之前，五个RT-qPCR阳性组织样本（G-10、G-13、G-17、G-21、G-37）在外部认证测序机构（Genomed S.A.，波兰华沙）尝试了全基因组NGS。采用了两种文库制备方案：NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit配合通用Imai流感引物，以及一步法RT-PCR扩增后机械打断。尽管每个样本生成了802,000–830,000条原始读段，但所有样本和两种方法均未有任何读段以有意义的覆盖率比对到任何A型流感H5N1片段。相比之下，优化的靶向工作流程成功地从全部七个组织样本中扩增并Sanger测序了H5和N1特异性片段。样本G-37因残留组织材料不足而无法重新处理。
3.2 Ct值的大幅降低
应用优化工作流程后，低初始病毒RNA载量组织样本中可扩增病毒RNA的可用性显著增加，表现为RNA纯化和浓缩后H5和N1特异性Ct值大幅降低。观察到的Ct值降低幅度超过仅由体积浓缩预期的程度，部分样本和靶标的Ct值降低超过10个循环，表明改善的RNA回收率和/或组织来源抑制剂的去除可能对检测性能有所贡献。优化实验比较了4 μL与7.6 μL模板体积（无浓缩步骤），显示所有八个样本一致改善0.4–1.9个Ct单位，证实了额外模板体积和浓缩步骤各自独立且累加地贡献于信号改善。
3.3 特异性验证
为评估方案特异性，研究纳入了阴性和不一致样本对照。来自两只H5N1阴性动物的肺组织经完整优化方案处理后，在4 μL和7.6 μL模板体积下均未检测到H5或N1信号。样本G-18在标准检测中产生不一致结果（H5 Ct=36.12；N1未检出），经浓缩后两个靶标均无信号检出。该边缘H5信号的消失支持原始信号为亚阈值伪影的解释：按每柱约5.3倍浓缩（80→15 μL），真实RNA应预期Ct降低约2–3个循环。
3.4 咽拭子样本验证
方案在咽拭子样本上进行了额外验证。样本G-13（雪貂）的拭子来源Ct值经浓缩后（H5: 25.11；N1: 25.78）与同期肺组织的基线诊断Ct值（H5: 25.62；N1: 26.03）相差约0.5个循环。样本G-42（猫，仅拭子）经浓缩后Ct值从32.53/33.12降至30.46/30.63（H5/N1）。
3.5 Sanger测序结果
靶向Sanger测序从全部七个分析样本中获得了可读的部分H5和N1序列。正向和反向读段经人工检查、比对并合并生成共有序列。去除引物结合区域后，所有七个样本共享一致的共有序列，包含87 bp的H5片段和96 bp的N1片段。BLAST 2.16.0分析确认与GenBank中提交的流感A(H5N1) HA和NA基因序列具有100%查询覆盖率和100%一致性。该可比工作流程（Total RNA Mini Kit提取、Clean-Up RNA Concentrator浓缩、Stefańska等引物组、Genomed Sanger测序）还被独立应用于欧洲野牛组织中的A/H1N1pdm检测，获得短扩增子并经BLAST确认100%一致性，证明了该方法在不同流感亚型和宿主物种间的可重复性。
四、讨论与结论
研究讨论部分指出，Ct值是检测体系和平台特异性的。本研究以Ct>25定义“低病毒载量”反映了所用RT-qPCR系统的性能特征，不应在未经验证的情况下应用于其他检测-仪器组合。研究未包含在Sanger测序步骤中失败的样本，因此无法定义失败阈值。回顾性设计和小样本量限制了对方案进行全面分析验证。
研究结论为：优化的工作流程通过系统性组合平行组织等分提取、RNA浓缩和增加模板体积，能够从低病毒载量的A/H5N1感染动物组织中产生足以进行稳健靶向Sanger测序的模板，实现H5和N1片段的成功扩增和测序，从而在常规诊断方法（包括全基因组NGS）失败的样本中确认HPAI H5N1亚型并进行靶向遗传表征。该方案为兽医诊断提供了一种实用的补救方案，对于监测哺乳动物宿主中A/H5N1病毒的进化和评估人畜共患风险具有重要意义。
