《Biosensors and Bioelectronics》：A One-Step Functionalized 3D-Printed Electrochemical Biosensor for Serotype-Selective Detection of Dengue NS1
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•开发了一种3D打印的电化学生物传感器，用于选择性检测登革病毒2型NS1蛋白。•使用抗体–金纳米颗粒偶联物实现一步生物功能化。•能够选择性区分登革病毒2型与登革病毒1型、寨卡病毒及基孔肯雅病毒的蛋白。•检测灵敏度高，检出限为0.71 pM（15分钟内），血清回收率为97.7%
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开发了一种3D打印的电化学生物传感器，用于选择性检测登革病毒2型NS1蛋白。
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使用抗体–金纳米颗粒偶联物实现一步生物功能化。
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能够选择性区分登革病毒2型与登革病毒1型、寨卡病毒及基孔肯雅病毒的蛋白。
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检测灵敏度高，检出限为0.71 pM（15分钟内），血清回收率为97.7%–106.0%。
引言
登革病毒（DENV）在热带和亚热带地区引发了反复的疫情暴发。尽管已在125个以上国家的大陆上报告了确诊病例，引发全球关注（Lim等，2025；Sirivibulkovit等，2025；世界卫生组织，2025）。登革热对拉丁美洲的影响尤为严重，2024年报告超过1300万例病例，2025年为430万例，其中巴西分别占约76%和86%（泛美卫生组织，2025a, 2025b）。由于四种病毒血清型（DENV-1至DENV-4）以及其他甲型病毒同时传播并产生相似的临床症状，登革热的诊断仍然面临挑战，导致大量误诊（Santos等，2023）。值得注意的是，2025年报告的病例中，经实验室确诊的比例不足40%，凸显了当前诊断和监测策略的显著局限性（Bar?ante和Cherem，2025；欧洲疾病预防与控制中心，2025；泛美卫生组织，2025b, 2025a）。在此背景下，选择性识别登革病毒血清型对于流行病学监测和临床决策具有重要意义，但使用传统诊断方法仍然困难（Bhatt等，2013；Guo等，2026；Lim等，2025）。
已确立的技术，如聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），虽然能提供可靠的检测结果，但需要多个处理步骤、实验室基础设施和经过培训的人员，这限制了其在快速和去中心化检测中的应用，也可能导致实验室确诊病例报告数量偏低（Liu等，2025）。因此，越来越多的关注转向了替代方法，这些方法能够实现更快、更简便的检测，同时不牺牲选择性。纳米结构材料和表面功能化策略的进展对开发具有改进界面性能和生物分子识别能力的诊断平台作出了重大贡献（Ding等，2024；Santos等，2020；Silveira等，2011）。特别是，金纳米颗粒（AuNPs）因其兼具高比表面积与光学和电化学特性而备受关注，而其简便的生物功能化使其能够在生物传感平台中实现高效的分子识别（Izumi等，2025）。
电化学生物传感器由于其低成本、快速响应以及与便携式和微型化设备的兼容性，在病毒诊断领域具有广阔的应用前景（Carvalho等，2026；Hasan等，2025；Raza等，2024）。此外，将这些进展与3D打印技术相结合，为电化学传感提供了诸多优势（Crapnell等，2026），包括快速且可重复的制造（Martins等，2026）、高设计灵活性（Ambrosi等，2016）、潜在的可持续性（Caldas等，2026），以及对电极几何形状和尺寸的简便定制（Foster等，2020）。
在现有的病毒生物标志物中（Bang等，2018；Chowdhury等，2020；Omar等，2020；Prado等，2025；Siew等，2021），非结构蛋白1（NS1）对于早期诊断尤为重要，因为它在感染的初始阶段就会在血液中出现（Vairaperumal等，2025；Yang等，2025）。尽管取得了显著进展，但目前报道的许多基于NS1的生物传感器（Chen等，2026；Darwish等，2018；Palomar等，2020；Sánchez-Purrà等，2017；Sinawang等，2018；Sitthisuwannakul等，2024）仍然涉及多步制造程序和较长的孵育时间，这可能影响可重复性并限制其实际应用（Martins等，2026）。此外，实现高选择性仍然具有挑战性，尤其是在区分登革病毒血清型以及将登革病毒与其他具有结构相关蛋白的共存甲型病毒区分开来时。因此，开发兼具操作简便性、短时间检测、高灵敏度以及能够在密切相关的甲型病毒之间进行可靠区分的电化学传感平台，仍然是登革热诊断领域的一项重大挑战。
在本研究中，设计了一种完全3D打印的电化学生物传感器，用于检测登革病毒2型NS1蛋白，采用了简化的电极功能化策略。该传感平台将3D打印的三电极系统与预组装的金纳米颗粒–抗体偶联物相结合，实现了表面的一步法修饰，并减少了传统生物功能化协议所需的制造步骤（图1）。检测基于通过循环伏安法监测电极上抗原–抗体识别后的电子转移动力学变化。该生物传感器在15分钟内即可检测到NS1，并表现出对登革病毒2型和登革病毒1型以及其他甲型病毒蛋白的选择性响应。简化的制造程序、短时间检测以及血清型选择性识别的结合，凸显了3D打印电化学平台在快速登革热诊断中的潜力。
章节摘要
材料与方法
所有化学品均未经纯化直接使用。四氯合金酸（HAuCl4·3H2O，99.995%）、3,3′-二巯基双（磺琥珀酰亚胺丙酯）（DTSSP）、四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O，98%）、硼酸（H3BO3，99.5%）、柠檬酸三钠二水合物（Na3C6H5O7·2H2O，99%）、牛血清白蛋白（BSA，96%）、石墨粉末（20 μm，98%）和人血清均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。三氯甲烷（99.8%）购自Synth（巴西迪亚德玛）。氯化钾（KCl，
生物偶联物的制备与表征
mAb-AuNP生物偶联物使用DTSSP作为交联剂进行制备（Filbrun等，2017）。在偶联过程中，DTSSP的二硫键部分通过Au–S相互作用与AuNP表面结合，而末端的N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）酯基团保持活性，可与抗登革病毒2型NS1单克隆抗体的伯胺基团反应，形成稳定的酰胺键。随后，加入牛血清白蛋白（BSA）以封闭剩余的未占据表面
结论
开发了一种基于G/PLA/mAb-AuNP界面的完全3D打印电化学生物传感器，用于选择性检测登革病毒2型NS1蛋白。使用预组装的抗体–金纳米颗粒生物偶联物进行一步法修饰，实现了简单且可重复的制造策略，同时保持了高分析性能。该生物传感器表现出高灵敏度、快速分析及对登革病毒2型NS1、登革病毒1型NS1、寨卡病毒NS1和基孔肯雅病毒E2蛋白的选择性区分能力。此外，令人满意的是
CRediT作者贡献声明
Dayenny Louise D'Amato：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，可视化，验证，方法论，调查，形式化分析，数据管理，概念化。Natália Marinho Caldas：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，可视化，验证，方法论，调查，形式化分析，数据管理，概念化。Célia Machado Ronconi：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，监督，资源获取，项目管理，
未引用参考文献
Bar?ante等，2025；欧洲疾病预防与控制中心，2025；泛美卫生组织，2025；泛美卫生组织，2025。
人工智能使用声明
作者仅使用人工智能（AI）辅助工具来提高语法、语言清晰度和文本可读性。所有科学内容、数据分析、结果解释、结论和最终手稿修订均由作者完成。作者对本工作的准确性、完整性和原创性承担全部责任。
利益冲突声明
? 作者声明不存在已知的、可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
作者感谢国家科学与技术发展委员会（CNPq）在资助编号315401/2023-0 CMR和Universal 404044/2023-9, RMD项目下的财政支持；感谢高等教育人员进修协调委员会（CAPES，财务代码001，资助编号88881.657699/2021-01）对DLD奖学金的资助。作者还感谢里约热内卢研究基金会（FAPERJ）通过以下资助提供的支持：Cientistas do Nosso Estado
Dayenny L. D'Amato|Natália M. Caldas|Lucas V. de Faria|Carolina B.P. Ligiero|Ana Beatriz C. Souza|Camille C. de Mello|Guilherme P. Oliveira|Rafael M. Dornellas|Célia M. Ronconi
