组织驻留巨噬细胞经Piezo1-NGF-TrkA轴构成自主机械感觉中继驱动慢性内脏痛

《Science Immunology》：An autonomous macrophage-nociceptor mechanosensory relay drives chronic visceral pain

　　

溃疡性结肠炎中的内脏痛通常归因于炎症级联反应，但免疫细胞是否能直接将机械信号转导为伤害性信号仍不清楚。本研究发现，组织驻留的CX3CR1⁺巨噬细胞中的机械敏感通道Piezo1直接驱动结肠炎相关的内脏痛觉过敏。Piezo1触发钙内流及核因子κB（NF-κB）核转位，后者占据Ngf启动子以诱导神经生长因子（NGF）合成。该巨噬细胞来源的NGF在神经免疫单元中重塑并敏化TRPV1⁺伤害性传入神经的外周末梢。研究人员利用低炎症的结肠内酵母聚糖模型发现，该Piezo1-NGF-TrkA轴在很大程度上独立于细胞因子级联反应，作为直接的感觉机械中继发挥功能。在驻留巨噬细胞中基因敲除Piezo1或Ngf，或在TRPV1⁺神经元中敲除Ntrk1，在炎症性和非炎症性模型中均消除了内脏痛觉过敏。这些发现揭示组织驻留巨噬细胞是自主机械传感器，在疾病状态下建立了一条直接、平行的疼痛传导通路至感觉神经。

慢性内脏痛严重影响溃疡性结肠炎患者的生活质量，但现有治疗手段有限且机制认识不足，使其临床管理面临困境。神经免疫交互是慢性疼痛的关键驱动因素。传统观点认为，伤害性感受器释放神经肽驱动神经源性炎症，而活化巨噬细胞释放细胞因子继发性敏化神经末梢，免疫细胞被视为炎症级联的下游效应细胞。然而，免疫细胞能否作为自主生物物理传感器，独立于细胞因子级联直接将组织改变转化为伤害性信号，此前尚不清楚。组织驻留CX3CR1⁺巨噬细胞具有自我更新能力，并与感觉神经形成直接解剖接触，构成“神经免疫单元”。尽管结肠炎中驻留巨噬细胞与浸润性CCR2⁺单核细胞均发生扩增，但不同巨噬细胞亚群对疼痛的贡献仍不明确。Piezo1作为调控钙内流的机械敏感通道，参与血管发育、免疫功能和疼痛调控，但其在内脏神经免疫界面的作用尚属空白。研究人员据此开展研究，旨在阐明组织驻留巨噬细胞能否通过Piezo1感知病理机械信号并直接驱动内脏痛觉信号传递。

研究人员通过多种遗传工具和功能性实验，系统解析了巨噬细胞Piezo1在结肠炎相关内脏痛中的作用机制。在炎症性葡聚糖硫酸钠（DSS）结肠炎模型和非炎症性结肠内酵母聚糖模型中，研究人员利用他莫昔芬诱导的细胞特异性条件敲除小鼠，分别敲除CX3CR1⁺驻留巨噬细胞或CCR2⁺浸润巨噬细胞中的Piezo1和Ngf，以及在TRPV1⁺神经元中敲除Ntrk1。研究采用内脏运动反应（VMR）评估结直肠扩张引起的内脏痛觉过敏，结合开放场运动行为、自发疼痛评分、组织学评分和结肠长度等指标综合评价疾病严重程度。机制层面，研究人员整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、Smart-seq转录组分析、RNAscope原位杂交、流式细胞术、活细胞Ca²⁺成像、原子力显微镜（AFM）力学测绘、切割下靶向及标签化（CUT&Tag）染色质分析、Olink蛋白质组学等多种技术手段。实验使用了来自人类溃疡性结肠炎活检组织和DSS小鼠结肠炎的公共scRNA-seq数据集，以及小鼠背根神经节（DRG）scRNA-seq图谱。小鼠品系包括Piezo1^f/f、Cx3cr1^cre(ERT)2、Ccr2^{cre(ERT)2/EGFP}、Trpv1^cre、Ai9、zsGreen、Ngf^f/f和Ntrk1^f/f等，Cx3cr1^EGFP-Ccr2^RFP双报告小鼠由南方医科大学珠江医院冯先丽实验室提供。

主要研究结果如下：

Piezo1在结肠巨噬细胞亚群中表达且具有功能：通过对人类UC结肠活检和DSS小鼠结肠炎的单细胞RNA测序数据再分析，结合流式细胞术、免疫荧光染色和RNAscope原位杂交，研究人员发现结肠炎期间巨噬细胞在免疫群体中扩增倍数最大，其中CX3CR1⁺驻留巨噬细胞比CCR2⁺浸润巨噬细胞表现出更显著的扩增。Piezo1 mRNA在CX3CR1⁺巨噬细胞中高表达，结肠炎期间两种巨噬细胞亚群的Piezo1表达均上调。利用Piezo1激动剂Yoda1进行的活细胞Ca²⁺成像证实，结肠炎来源的巨噬细胞表现出增强的Piezo1功能活性，该反应可被特异性抑制剂Dooku1消除。

CX3CR1⁺巨噬细胞中的Piezo1对内脏痛至关重要：通过生成巨噬细胞特异性Piezo1条件敲除小鼠，研究人员发现CCR2⁺浸润巨噬细胞中的Piezo1缺失对DSS诱导的结肠炎、内脏痛觉过敏或运动活动均无影响，表明浸润巨噬细胞的Piezo1并非内脏痛所必需。相反，CX3CR1⁺驻留巨噬细胞中Piezo1缺失显著降低DSS诱导的内脏痛觉过敏，改善疾病严重程度，包括减轻体重下降、增强开放场运动表现和减少自发疼痛行为。Smart-seq转录组分析显示，Piezo1缺失的驻留巨噬细胞中多种促炎细胞因子（如Il1b、Ifng、Il33）广泛下调。

巨噬细胞Piezo1在酵母聚糖模型中独立于明显黏膜炎症驱动内脏痛觉过敏：研究人员使用低炎症的结肠内酵母聚糖模型将黏膜炎症与伤害性感受器敏化解耦。酵母聚糖处理的小鼠表现出升高的VMR反应，但结肠长度、组织学评分、巨噬细胞丰度、炎性细胞因子表达和Olink蛋白质组学谱均无明显变化。然而，CX3CR1⁺驻留巨噬细胞在转录和功能水平选择性上调Piezo1。在该模型中，驻留巨噬细胞特异性Piezo1缺失减弱了VMR反应，而结肠形态和组织学无差异，表明Piezo1对内脏痛觉过敏的贡献至少部分独立于经典炎症级联。

Piezo1依赖的NF-κB激活驱动CX3CR1⁺驻留巨噬细胞中Ngf转录：对DSS处理的CX3CR1⁺巨噬细胞进行RNA-seq和KEGG通路富集分析，NF-κB信号通路富集最为显著。在DSS和酵母聚糖两种模型中，驻留巨噬细胞的Nfkb1和RelA表达均升高，而Piezo1缺失可降低其表达。CUT&Tag实验直接证明NF-κB（p65/RelA）在DSS条件下物理占据驻留巨噬细胞Ngf启动子上的κB结合元件，揭示了Piezo1-NF-κB-Ngf的转录级联。

Piezo1驱动的驻留巨噬细胞NGF释放调节结肠感觉神经重塑：原子力显微镜力学测绘显示，DSS和酵母聚糖模型均导致结肠组织硬度（Young's模量）增加，这一组织僵硬度变化为Piezo1提供了持续的机械刺激。DSS和酵母聚糖处理后，CX3CR1⁺巨噬细胞中Ngf mRNA上调，该上调依赖Piezo1；Yoda1可增强Ngf表达，Dooku1则取消该效应。DSS处理增加TRPV1⁺/PGP9.5⁺纤维密度并使其靠近CX3CR1⁺巨噬细胞，而CCR2⁺浸润巨噬细胞与神经纤维无明显空间关联。在驻留巨噬细胞中敲除Piezo1或Ngf均阻断了感觉纤维扩增，表明巨噬细胞来源NGF驱动感觉神经结构性重塑。

Piezo1依赖的驻留巨噬细胞NGF释放促进结肠炎相关内脏痛：Cx3cr1^cre(ERT)2; Ngf^f/f小鼠在基础状态下内脏机械敏感性和结肠形态正常，表明巨噬细胞来源NGF对稳态伤害性神经支配非必需。DSS处理后，Ngf缺失小鼠表现出减轻的结肠炎症和降低的内脏痛觉过敏。在酵母聚糖模型中，尽管两种基因型间结肠形态、组织学评分、巨噬细胞丰度和Olink蛋白质组学无差异，Ngf缺失仍减弱了VMR反应，证明NGF是直接、独立于炎症的伤害性效应分子。重组NGF重复结肠内给药可升高VMR反应，而腹腔给药无效。

TRPV1⁺神经元中Ntrk1的基因缺失减弱结肠炎相关内脏痛：DRG scRNA-seq分析显示Ntrk1（TrkA）在肽能（PEP）伤害性神经元簇中与Trpv1共富集。DSS处理特异性上调TRPV1⁺PEP神经元中Ntrk1表达，该上调在巨噬细胞Piezo1缺失后减弱。Trpv1^cre; Ntrk1^f/f小鼠在基础状态下表型正常，DSS处理后内脏痛觉过敏显著减弱，炎症减轻。TrkA选择性拮抗剂GW-441756和TRPV1⁺纤维药物消融（resiniferatoxin）同样验证了该通路。在酵母聚糖模型中，Ntrk1缺失同样减弱VMR反应，进一步确认NGF-TrkA信号在TRPV1⁺神经元中介导感觉神经重塑和内脏痛觉过敏，且在炎症背景之外仍可独立运作。

讨论部分指出，本研究的核心概念性进展在于描绘了一条直接、平行的巨噬细胞-伤害性感受器机械感觉中继通路，与经典炎症级联并行运作。利用酵母聚糖模型在无显著黏膜炎症状态下分离出该机械传导路径，证实巨噬细胞介导的伤害性感受是直接高效的互补通路而非细胞因子释放的下游结果。原子力显微镜数据表明结肠基质僵硬度是Piezo1的上游生物物理触发因素，提供了持续、空间分布广泛的机械输入。驻留CX3CR1⁺巨噬细胞在解剖上占据黏膜下层和肌层的神经免疫单元，与感觉神经形成稳定接触，这解释了其相对于空间距离较远的CCR2⁺浸润巨噬细胞的功能重要性。该机制还可与肠道中其他机械传感器整合，如Piezo2介导的伤害性感受器机械转导和肠内分泌细胞的机械感知，NGF可进一步增强伤害性感受器Piezo2的敏感性，形成双向交互。该发现为理解IBD中黏膜愈合与腹痛缓解脱节的临床现象提供了机制框架——组织生物力学的持续病理性改变可通过驻留巨噬细胞自主维持伤害性信号，即使活动性黏膜炎症消退后内脏痛仍可存在。

研究结论部分可概括为：组织驻留CX3CR1⁺巨噬细胞通过Piezo1感知结肠组织僵硬度增加，触发钙内流和NF-κB核转位，驱动Ngf转录及NGF释放；巨噬细胞来源NGF通过其高亲和力受体TrkA作用于TRPV1⁺伤害性神经元，重塑并敏化外周神经末梢，最终导致内脏痛觉过敏。该Piezo1-NGF-TrkA神经免疫机械感觉中继在炎症性和非炎症性内脏痛模型中均发挥关键作用，构成一条独立于经典细胞因子级联的直接疼痛传导通路。靶向该机械感觉轴的特定组分，有望为慢性内脏痛提供精准治疗策略，在实现有效镇痛的同时避免损害全身免疫监视功能。