基于Siral 40的脂肪酶固定化用于酯合成：实验与分子对接联合研究

《Catalysis Today》：Lipase Immobilization on Silica-Alumina (Siral 40) for Ester Synthesis: a Combined Experimental and Molecular Docking Study

　　

酯化反应被广泛用于生产增值化学品，包括生物燃料、燃料添加剂、生物润滑剂、增塑剂和药用辅料。由脂肪酸和生物质基平台分子衍生得到的烷基酯作为石油衍生品的替代品日益受到关注[1-3]。油酸乙酯（ethyl oleate, EO）由油酸（oleic acid, OA）制备，是一种长链脂肪酸酯，可用作生物柴油组分、燃料添加剂、生物润滑剂，并在制药和化工领域具有应用价值[4-7]。乙酰丙酸乙酯（ethyl levulinate, EL）由生物质衍生乙酰丙酸（levulinic acid, LA）酯化获得，是一种含氧酯，可作为燃料添加剂及生物基化学品中间体[8,9]。

更可持续合成路线的开发促进了脂肪酶作为生物催化剂用于酯生产。与传统化学工艺相比，脂肪酶催化反应具有高选择性和温和操作条件等优势，能够减少副反应并保护敏感官能团[10-12]。脂肪酶催化酯化反应受反应介质强烈影响。作为可逆且受热力学控制的过程，其可达转化率受化学平衡制约，而脂肪酶影响的是趋近平衡的速率而非平衡位置[13-15]。酯化过程中生成的水可使平衡朝反应物方向移动并促进逆水解反应，同时水活度还会影响酶的结构、柔韧性、底物可及性和稳定性[13,16,17]。有机溶剂能够改变底物溶解度、黏度、传质和酶微环境，而无溶剂操作则减少溶剂消耗并简化下游处理，但可能增加黏度、传质阻力和局部底物浓度[18,19]。这些效应凸显了本体反应介质和生物催化剂周围微环境对酯化性能的共同重要性。

脂肪酶提供的选择性和温和反应条件是食品和制药工业中公认的优势，这些领域对底物结构和官能团的保留往往至关重要。这些特点也可能与本文研究的底物相关。对于油酸，温和条件有助于保留C=C不饱和键并限制不期望的副反应；对于乙酰丙酸，脂肪酶催化酯化可在保留酮官能团的同时选择性转化羧基。然而，在能源相关应用中，这些催化优势必须与酶成本、生产率、稳定性和可重复使用性相权衡。

固定化被广泛用于促进酶的回收和再利用，但其效应不仅限于操作优势。根据固定化方法和载体的不同，酶稳定性、活性、选择性、特异性及对抑制的敏感性均可能发生显著改变[19-24]。因此，高蛋白固定化产率并不必然转化为高催化性能。其他互补性策略包括热稳定酶的利用或发现、宏基因组筛选、蛋白质工程、分子设计和化学修饰等[25-27]。

在固定化方法中，吸附因其简单、相对廉价且可在温和条件下进行而尤为具有吸引力[20,28]。对脂肪酶而言，疏水相互作用不仅有助于酶保留，还可能参与稳定催化相关构象。疏水载体可模拟底物界面，通过界面活化促进脂肪酶吸附，并可能稳定其开放构象[29,30]。所得生物催化剂的性质强烈依赖于酶、载体及二者在吸附过程中建立的相互作用。

在合成中广泛使用的脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CalB）和米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase, RML）因广泛的合成适用性和在非水条件下操作的能力而尤为重要[29-32]。CalB和RML均具有广泛的底物特异性和在选择性合成反应中的成熟应用，然而二者在结构和催化性质上存在差异，这些差异可能影响底物识别及其对固定化的响应。RML具有经典的界面活化机制，而CalB的lid较小且高度活动，不能完全封闭活性位点，因而表现出不同的界面行为[29,33]。

多孔硅铝酸盐因其高比表面积、可调孔结构及有利于酶吸附的表面化学性质而成为有吸引力的酶固定化载体[34-36]。Siral 40是一种商品化硅铝酸盐，具有介孔性、高比表面积、表面酸性和部分疏水特性。Siral类材料此前已被本课题组用于脂肪酶固定化研究[34,36,37]，为其作为生物催化剂载体提供了实验基础。然而，其在脂肪酶催化酯化中的应用仍相对较少被探索，尤其是在相同实验条件下系统比较不同脂肪酶和化学结构不同底物的研究。

分子对接可通过提供底物在酶活性位点内的容纳和相互作用信息来补充实验比较。然而，基于游离酶晶体结构的对接无法再现固定化状态，因为酶-载体相互作用可能改变酶构象、活性位点可及性和催化性质[38,39]。因此，本研究将对接作为研究CalB和RML对底物内在识别的补充工具，而非固定化酶的结构表示。

在此背景下，研究人员通过吸附将CalB和RML固定化于Siral 40上，并在两种结构不同的羧酸的酯化反应中进行评价：OA为长链不饱和脂肪酸，LA为含有羧基和酮官能团的较短且极性更强的生物质衍生分子。所得生物催化剂与相应的非固定化商业酶制剂及已建立的固定化生物催化剂Novozym? 435和Lipozyme? RM IM进行了性能对比。研究评价了固定化性能、底物摩尔比和生物催化剂重复使用性，并利用差异脱附研究了脂肪酶在Siral 40上的保留情况。使用游离酶晶体结构的分子对接通过考察内在底物识别补充了实验结果。本工作的新颖性在于系统比较了两种工业相关脂肪酶在相对较少被探索的Siral 40载体上的固定化，整合了两种化学结构不同的底物、与商业酶制剂的直接对比，以及实验与分子层面的互补分析。

**基于Siral 40的脂肪酶固定化用于酯合成：实验与分子对接联合研究的论文解读**

**1. 研究背景与问题的提出**

酯化反应是生产生物燃料、燃料添加剂、生物润滑剂和药物辅料等增值化学品的重要途径。油酸乙酯（EO）和乙酰丙酸乙酯（EL）作为两类代表性的脂肪酸酯，分别源自油酸（OA）和生物质衍生的乙酰丙酸（LA），在可再生能源和绿色化工领域具有广阔应用前景。与化学催化相比，脂肪酶催化酯化具有高选择性、温和反应条件以及保护敏感官能团等优势，但酶成本、稳定性和可重复使用性是制约其工业应用的关键因素。

固定化技术可实现酶的回收和重复利用，但固定化对酶的影响不仅限于操作层面，还可能改变酶的稳定性、活性、选择性和对抑制的敏感性。高蛋白固定化产率并不必然意味着高催化性能，因此需要在特定酶-载体-底物-反应介质体系中对固定化效果进行综合评价。吸附法因操作简单、成本低廉、条件温和而被广泛采用，尤其对于脂肪酶，疏水载体可通过界面活化稳定其开放构象，提升催化性能。

Siral 40是一种商业化的介孔硅铝酸盐，具有高比表面积、可调的孔结构、表面酸性和部分疏水特性，是脂肪酶固定化的潜在优良载体。然而，其在脂肪酶催化酯化中的应用研究仍相对匮乏，尤其是在相同条件下系统比较不同脂肪酶和结构不同底物的研究更少。分子对接可提供底物在酶活性位点内结合和取向的信息，但游离酶晶体结构的对接结果无法完全反映固定化状态。因此，本研究旨在通过实验与分子对接的联合分析，系统评价CalB和RML在Siral 40上固定化后对OA和LA两种结构不同底物的酯化性能，并揭示底物结构、酶种类和固定化环境对催化性能的影响机制。

**2. 研究技术方法概述**

研究人员以Siral 40为载体（BET比表面积451 m2 g?1，介孔体积0.845 cm3 g?1，孔径30–200 ?，总酸位密度约0.415 mmol g?1），通过吸附法固定化南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）和米黑根毛霉脂肪酶（RML），固定化条件为pH 7.0磷酸盐缓冲液、25 °C、2 h。以油酸和乙醇（1:1摩尔比）的酯化反应测定酯化活性，以对硝基苯基月桂酸酯（pNPL）水解测定水解活性。通过2.2.7节所述方法计算蛋白固定化产率（YP）、活性固定化产率（YA）、蛋白载量（LP）和表达活性（EA）。采用NaCl和Tween 20进行差异脱附实验，考察离子和疏水相互作用对酶保留的贡献。酯化反应在40 °C下进行，EO合成采用无溶剂体系，EL合成添加50%（v/v）叔丁醇。重复使用性通过连续多次EO合成循环评价。分子对接采用AutoDock Vina，以CalB（PDB: 1TCA）和RML（PDB: 4TGL）的晶体结构为受体，对OA和LA进行对接模拟。底物摩尔比效应以N435为催化剂，在30 °C下分别改变OA/乙醇和LA/乙醇的摩尔比进行考察。

**3. 主要研究结果**

**3.1 脂肪酶在Siral 40上的固定化**

Siral 40的高比表面积、介孔结构（50–100 ?）和异质表面化学性质为脂肪酶吸附提供了有利条件。CalB和RML在30 min内蛋白固定化产率即超过80%，2 h后分别达到92%和86%，对应蛋白载量分别为9.2和8.6 mg g?1载体。酯化活性测定显示，CalB-S40和RML-S40的酯化活性分别为656.3和638.2 U g?1，对应比活性为71.3和74.2 U mg?1。根据Boudrant等人定义，CalB-S40的表达活性（EA）为302%，RML-S40为115%，表明固定化对两种酶催化性能的影响不同。差异脱附实验表明，CalB-S40在Tween 20存在下脱附率（48.2%）远高于NaCl（19.8%），显示疏水相互作用主导CalB的保留；而RML-S40在NaCl和Tween 20存在下脱附率分别达76.5%和77.5%，表明RML的保留对离子强度和疏水破坏均高度敏感。这些结果表明，Siral 40上脂肪酶的保留机制具有酶依赖性。

**3.2 油酸和乙酰丙酸的酯化性能**

在EO合成中，商业固定化酶N435和RM IM转化率最高（约54%和53%），Siral 40衍生物RML-S40和CalB-S40分别达约46%和38%，均优于对应的非固定化酶制剂（RML 34%，CalB 31%），表明Siral 40固定化对EO合成有积极效果。然而在EL合成中，非固定化CalB和N435转化率约48%，而CalB-S40仅约8%，所有RML基制剂转化率均低于1%。这种显著差异表明固定化对催化性能的影响依赖于底物和反应体系。CalB-S40在两种反应体系中的对比行为说明，Siral 40固定化虽然在EO合成中有益，但在EL合成中却显著降低了CalB的催化效率。RML制剂对LA普遍低活性则提示酶的内在识别特性可能是主要原因。

**3.3 固定化脂肪酶的可重复使用性**

在EO合成的连续三次循环中，N435保持约98%、95%和89%的相对转化率，RM IM为68%、67%和51%，而CalB-S40在第一次重复使用时保留46%，第三次降至29%；RML-S40则在第一次和第二次重复使用中仅保留28%和21%，第三次几乎完全丧失催化性能。差异脱附结果与可重复使用性趋势一致：RML-S40的弱保留特性导致其催化性能在连续使用中急剧下降，而CalB-S40相对较强的疏水相互作用赋予其更好的操作稳定性。

**3.4 分子对接研究**

分子对接结果表明，OA在CalB和RML活性位点中均具有有利的结合构象，预测结合亲和力分别为?5.9和?5.7 kcal mol?1，与底物形成包括催化丝氨酸（Ser105/Ser144）氢键在内的多种相互作用。相比之下，LA的预测结合亲和力较低（CalB ?4.5，RML ?4.6 kcal mol?1），且两种酶之间的结合能差异很小。然而，LA在CalB中采取的反应性羧基朝向催化区域的取向较为有利，而在RML中羧基的取向则不利于催化。这为RML制剂对LA极低活性提供了分子层面的解释。同时，CalB-S40与N435在EL合成中的显著差异无法由游离酶对接模型解释，表明固定化环境和反应介质对催化性能具有重要贡献。

**3.5 底物用量和摩尔比对酯合成的影响**

以N435为催化剂考察底物摩尔比影响时发现，EO合成在低底物量下乙醇过量（OA:EtOH = 1:2）有利于转化，而在高底物量下最优摩尔比趋向化学计量（1:1）。EL合成在低底物量下LA过量有利，但底物量增加后转化率显著下降。双倒数图呈现明显的非线性弯曲，表明高底物浓度下存在浓度依赖的抑制作用，但无法区分具体抑制机制。这些结果说明底物摩尔比对酯化性能的影响不能脱离底物绝对用量和反应介质组成来单独考量。

**4. 讨论与结论**

本研究的综合结果表明，Siral 40的表面和结构特征有利于两种脂肪酶的快速吸附和高蛋白固定化产率，但高固定化产率并未转化为等同的催化性能。固定化效果因酶种类和反应体系而异：Siral 40固定化在EO合成中优于非固定化酶，但在EL合成中性能较差，尤其对RML而言。可重复使用性方面，CalB-S40优于RML-S40，差异脱附结果与其保留强度一致。分子对接揭示了CalB和RML对底物内在识别的差异，特别是LA在RML活性位点中的不利取向，但无法解释固定化环境引起的性能差异。底物用量实验表明，酯化性能受底物浓度、摩尔比和反应介质组成的综合影响。

研究结论指出，固定化脂肪酶的性能不能仅以固定化产率推断，而必须在具体的酶-载体-底物-反应介质体系中评估。Siral 40作为固定化载体在EO合成中表现良好，但在EL合成中效果有限，其应用需要针对特定反应体系优化固定化策略和反应条件。未来的研究应侧重于通过优化固定化方法提高酶保留率和可重复使用性，并针对特定酶-底物体系调整反应条件。本工作为合理设计脂肪酶固定化生物催化剂提供了实验和分子层面的依据，强调了固定化脂肪酶性能评估中系统性和底物特异性的重要性。