《COVID》：Tempo and Trajectories of SARS-CoV-2 Evolution: A Six-Year Genomic Analysis (2019–2025) of 1.13 Million Genomes
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背景：即使在SARS-CoV-2传播六年后，并相继出现包括Alpha、Delta和Omicron谱系（BA.*、XBB、JN.1、XFG）在内的多个关切变异株后，该冠状病毒仍在持续挑战公共卫生。大规模分析对于理解其适应机制及潜在的突变过程至关重要。目的：为解决
背景：即使在SARS-CoV-2传播六年后，并相继出现包括Alpha、Delta和Omicron谱系（BA.*、XBB、JN.1、XFG）在内的多个关切变异株后，该冠状病毒仍在持续挑战公共卫生。大规模分析对于理解其适应机制及潜在的突变过程至关重要。目的：为解决这一问题，研究人员量化了每个基因组位点的突变频率，并追踪这些突变在整个大流行期间随时间的变化。利用涌现斜率，研究人员识别出快速涌现的突变，并研究了整体突变谱在大流行过程中如何发生转变。方法：研究人员分析了113万条完整的SARS-CoV-2基因组序列（来自NCBI Virus数据库；时间跨度2019年12月至2025年9月），并按月进行分箱处理。采用Minimap2和SAMtools以未设上限的堆叠深度进行基于参考基因组的比对（参考序列为NC_045512.2）。涌现斜率通过对突变频率与时间进行线性回归计算得出，而最近十二个月内上升的等位基因则分别通过拟二项逻辑斯蒂回归进行建模。结果：全基因组景观揭示了刺突蛋白（Spike，S）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）中的高频突变热点。同时，研究还识别出与关切变异株主导地位相对应的不同演化阶段。突变谱始终由C>T替换主导，而G>T替换率的变化则与谱系更替相关，尤其是在Delta时期之后出现了显著下降。涌现斜率图谱突出了集中在刺突蛋白上的适应性信号。由于频率存在边界限制，整体斜率存在一个算术最大值，该值由位于观测窗口中央的一次选择性扫荡达到；斜率最高的位点是刺突蛋白和ORF1a上的位点，这些位点在2022年5月至2023年12月期间频率超过了99%，并在此后保持稳定。在最近的十二个月内，有14个等位基因从低于5%的频率上升至超过50%。其中八个是同义突变，并且所有这些等位基因都属于同一个重组体（XFG）单倍型，通过该等位基因集合可以以97.7–100%的灵敏度恢复谱系分配。结论：SARS-CoV-2在其出现六年后仍在快速演化，刺突蛋白仍然是其适应的关键靶点。突变谱的变化显示了病毒与宿主相互作用是如何实时发生的（例如复制生态位的改变）。应用于近期时间窗口的等位基因频率指标提供了一种可扩展、不依赖系统发育的监测手段，能够在无需构建进化树的情况下恢复谱系定义。
研究背景、现存问题与研究动机
新型冠状病毒SARS-CoV-2自2019年底出现以来，已在全球范围内引发大流行，并持续演化出包括Alpha、Delta、Omicron及其亚谱系在内的多个关切变异株。尽管已有大量研究关注病毒的基因组变异，但现有的大规模基因组监测工作多依赖于系统发育树重建、进化枝分配或预先定义的谱系命名，缺乏一种可直接追踪全基因组核苷酸频率变化而不依赖系统发育的可扩展框架。此外，以往研究常聚焦于谱系定义性的氨基酸改变，而对全基因组范围内的核苷酸突变轨迹随时间变化的系统性分析不足。因此，为了深入理解SARS-CoV-2的长期演化动态、突变机制的潜在变化以及当前正在涌现的新突变特征，有必要开展一项覆盖整个大流行周期的大规模基因组分析。
研究内容、主要结论与意义
研究人员对113万条SARS-CoV-2完整基因组序列进行了分析，时间跨度为2019年12月至2025年9月。研究发现，SARS-CoV-2的突变谱始终由C>T转换主导，但G>T颠换的频率随谱系更替而动态变化，尤其在Delta时期升高后在Omicron时期显著下降，这反映了病毒复制生态位的可能转变。全基因组突变频率景观显示，高频突变热点主要集中在刺突蛋白和核衣壳蛋白基因区域，其中多个位点为已知的关切变异株标志性突变。通过计算整体涌现斜率，研究人员发现最高斜率的位点对应于2022–2023年间完成的选择性扫荡事件，而最近十二个月（2024年9月至2025年8月）内，有14个等位基因频率从低于5%迅速上升至超过50%，其中8个为同义突变，且全部属于一个新的重组谱系XFG的单倍型。这一结果表明，SARS-CoV-2在出现六年后仍保持快速演化，刺突蛋白持续作为免疫逃逸的关键靶点，而所提出的涌现斜率指标提供了一种不依赖系统发育、可扩展的实时监测工具。
主要关键技术方法
研究人员从NCBI Virus数据库获取了1,134,166条完整SARS-CoV-2基因组序列，时间范围为2019年12月至2025年9月，并按月进行分箱处理。采用基于参考基因组NC_045512.2的映射策略，使用Minimap2进行序列比对，并通过SAMtools提取每个位点的核苷酸组成。突变频率定义为支持非参考等位基因的基因组数占覆盖该位点总基因组数的比例。涌现斜率通过对突变频率与时间进行线性回归计算得到，包括涵盖整个研究周期的整体涌现斜率和仅使用最后三个月数据的近期涌现斜率。此外，对最近十二个月内频率显著上升的等位基因进行了拟二项逻辑斯蒂回归建模。
研究结果
3.1 全基因组突变频率景观：研究人员绘制了全基因组突变频率分布图，发现高频突变热点主要集中在刺突蛋白基因区域，核衣壳蛋白基因及ORF1ab的特定区域也存在明显峰值。多个高峰对应已知的关切变异株标志性突变，如D614G和N501Y。
3.2 时间动态与克隆替代：通过时间热图可视化，研究人员展示了突变频率超过5%的位点随时间的变化，清晰呈现了各关切变异株依次占据主导地位的过程，包括2020年D614G的固定、2021年Alpha和Delta的更替、2022年Omicron对Delta的取代，以及2023–2025年XBB、JN.1和XFG谱系的连续涌现。重复出现的垂直条纹表明关键位点发生了趋同演化。
3.3 突变谱的纵向变化：研究人员分析了突变谱随时间的变化，发现C>T突变在整个大流行期间始终占主导地位，但其相对频率从2020年的约50%逐渐下降至2023年后的稳定水平34–35%。G>T突变的比例在Delta时期升高，而在Omicron出现后显著下降。2023–2025年间，突变谱趋于稳定，其他转换如A>G略有增加。
3.4 涌现的全基因组景观：通过计算整体涌现斜率，研究人员发现正向涌现的突变高度集中于刺突蛋白基因，表明持续的适应压力，而负向涌现的突变则对应于被取代的变异株标志物，如Delta相关突变。大部分基因组位点的涌现斜率接近零，代表准中性背景或已固定的突变。
3.5 快速涌现突变的识别：排名前十二的整体涌现斜率位点均达到了理论算术最大值的94.5%–99.5%，对应于2022年5月至2023年12月间完成的完全选择性扫荡事件。在最近十二个月内，有14个等位基因频率从低于5%上升至超过50%，其中8个为同义突变，且所有14个等位基因均属于XFG重组谱系。通过该等位基因集合分类基因组，可以以97.7%–100%的灵敏度和98.9%–100%的精确度复现XFG谱系分配，表明这些等位基因共同描述了一个正在扩张的单倍型，而非独立的适应性事件。
讨论与结论
研究人员指出，SARS-CoV-2展现出持续快速的适应能力，截至2025年9月仍未出现演化平台期。突变谱的动态变化反映了病毒与宿主相互作用的实时调整，特别是G>T颠换的减少与Omicron在上呼吸道复制的偏好一致。刺突蛋白是主要的突变热点和适应靶点，多个密码子发生了反复的氨基酸改变甚至重新获得丢失的非参考残基，这是趋同演化的明确证据。涌现斜率作为一种可扩展的观测指标，能够在不依赖系统发育树的情况下实现近实时监测，适用于国家监测系统和废水监测计划。研究结论强调，基于113万基因组六年分析，SARS-CoV-2仍快速演化，持续、实时的基因组监测对于追踪不断演变的威胁至关重要。
