《Cellular Signalling》：Structural integrity of the EpoR WSXWS region is required for ligand-independent JAK2-V617F signaling and tumorigenesis
编辑推荐：
摘要酪氨酸激酶JAK2（Janus激酶2）中的JAK2-V617F点突变是髓系增殖性肿瘤（MPNs）的已知驱动因子。该突变蛋白处于组成性激活状态，并通过由促红细胞生成素受体（EpoR）介导的信号通路发挥其致癌潜能。尽管EpoR胞外段的WSXWS基序（Trp-Ser-X-Trp
摘要
酪氨酸激酶JAK2（Janus激酶2）中的JAK2-V617F点突变是髓系增殖性肿瘤（MPNs）的已知驱动因子。该突变蛋白处于组成性激活状态，并通过由促红细胞生成素受体（EpoR）介导的信号通路发挥其致癌潜能。尽管EpoR胞外段的WSXWS基序（Trp-Ser-X-Trp-Ser）被认为参与受体的折叠与转运，但其对JAK2-V617F驱动的致癌过程的具体贡献尚未完全阐明。本研究在Ba/F3细胞中，将一系列EpoR WSXWS突变体（W232A、S233A、W235A、S236A和S236N）与野生型JAK2或JAK2-V617F共同表达进行评估。生化分析表明，W232A、S233A、W235A和S236N等替换导致受体加工异常，伴有细胞表面表达降低和Epo结合受损。相比之下，S236A突变体的糖基化及加工特征与野生型EpoR相当，能被有效转运至质膜，并保留了相当程度的Epo结合活性。免疫沉淀实验表明，野生型JAK2和JAK2-V617F均能与所有EpoR构建体发生物理相互作用。S236A的共表达可维持野生型JAK2和JAK2-V617F介导的Epo依赖性STAT5磷酸化及细胞增殖。然而，S236A显著减弱了配体非依赖性JAK2-V617F/STAT5激活，且未能支持强效的细胞因子非依赖性生长。此外，与野生型EpoR不同，所有WSXWS突变体均未支持JAK2-V617F在Ba/F3移植模型中驱动的肿瘤形成或脏器肿大。综上所述，本研究结果表明，仅保持受体在细胞表面的定位不足以驱动强效的JAK2-V617F激活，WSXWS区域的完整性是EpoR支持配体非依赖性JAK2-V617F信号传导及在此模型中转化的功能性必需条件。
引言
I型细胞因子受体具有特定的保守结构特征。其胞外结构域通常包含四个保守的半胱氨酸残基和一个膜近端的Trp-Ser-X-Trp-Ser（WSXWS）基序，其中X代表任何非保守氨基酸。其胞质结构域含有Box1和Box2基序，这两个基序对于招募Janus激酶（JAK）家族成员至关重要，如JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2 [1]、[2]、[3]。促红细胞生成素受体（EpoR）是I型细胞因子受体家族的重要成员，通过其Box1和Box2基序与JAK2特异性相互作用 [4]、[5]。
此前利用EpoR点突变体（携带WSXWS基序替换）的分析表明，该区域在EpoR功能中起关键作用。Quelle等人报道，WSXWS基序中色氨酸残基的突变会降低EpoR的配体结合亲和力，但不影响其细胞表面表达，提示该基序在配体识别中具有关键作用 [6]。此外，Yoshimura等人及Hilton等人发现，在WSXWS序列中存在缺失、插入或替换的EpoR突变体滞留在内质网（ER）中，且无法结合Epo，表明WSXWS基序对蛋白质的正确折叠和转运同样至关重要 [7]、[8]。
JAK2基因中的体细胞突变（V617F）在大多数髓系增殖性肿瘤（MPNs）患者中可被检出 [9]、[10]。已有充分文献记载，当突变型JAK2（JAK2-V617F）与EpoR共表达时，可在不依赖Epo刺激的情况下持续激活 [11]。JAK2-V617F与EpoR的共表达赋予依赖白介素-3（IL-3）的造血细胞系Ba/F3以生长因子非依赖性 [12]。此外，表达JAK2-V617F和EpoR的Ba/F3细胞在裸鼠体内可轻易形成肿瘤，证实JAK2-V617F仅在EpoR存在的情况下才作为强效致癌蛋白发挥作用 [13]。
JAK2在其N端含有一个4.1蛋白、ezrin、radixin、moesin（FERM）结构域，该结构域是JAK2与EpoR相互作用所必需的 [14]、[15]。值得注意的是，当FERM结构域中引入点突变（Y114A）时，JAK2-V617F无法与EpoR结合，从而导致失活，提示JAK2-V617F激活需要与EpoR发生物理结合 [16]。在促红细胞生成素（Epo）刺激下，野生型JAK2被激活并磷酸化EpoR胞质结构域中的酪氨酸残基，进而激活转录因子信号转导和转录激活因子5（STAT5）以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt和Raf-丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）-细胞外信号调节激酶（ERK）通路 [17]、[18]、[19]。相比之下，组成性激活的JAK2-V617F在不依赖Epo刺激的情况下磷酸化EpoR并触发这些下游信号级联反应，包括EpoR中三个关键酪氨酸残基（Tyr-343、Tyr-460和Tyr-464）的磷酸化，这对于JAK2-V617F驱动的细胞转化至关重要 [20]。尽管这些发现表明JAK2-V617F激活不需要配体结合能力，但WSXWS基序在介导JAK2-V617F转化能力中的确切作用仍有待阐明。
在本研究中，我们通过使用一组在WSXWS基序内含有替换的EpoR突变体，考察了EpoR WSXWS基序在JAK2-V617F驱动的致癌信号传导中的重要性。我们的结果表明，WSXWS区域的替换并不会消除EpoR与JAK2-V617F的物理相互作用，但该基序的完整性对于EpoR有效驱动配体非依赖性JAK2-V617F信号传导和转化是必不可少的。
章节摘要
试剂与抗体
重组人促红细胞生成素（Epo；ESPO 3000）和重组小鼠白介素-3（IL-3）分别购自麒麟啤酒公司（日本东京）和PeproTech（美国新泽西州洛克威谷）。嘌呤霉素和潮霉素购自InVivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。使用的一抗如下：抗磷酸化JAK2（Tyr-1007/1008）、抗磷酸化STAT5（Tyr-694）和抗STAT5（Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）；抗β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。
WSXWS区域突变体的Epo结合能力与细胞表面表达
EpoR是细胞因子受体超家族的一员，其特征是胞外结构域含有四个保守的半胱氨酸残基和一个WSXWS基序 [1]。为评估WSXWS基序在经典的Epo诱导的信号通路和致癌性JAK2-V617F介导的信号通路中的重要性，我们首先生成了五种EpoR突变体（W232A、S233A、W235A、S236A和S236N），同时还包含JAK2-V617F（图1A）。C端带Flag标签的EpoR构建体与……在Ba/F3细胞中表达。
讨论
本研究证明，EpoR WSXWS基序的结构完整性对于JAK2-V617F在Ba/F3模型中驱动的转化是必不可少的。此前，WSXWS基序已被公认为对配体依赖性受体折叠及向质膜的转运至关重要 [6]、[7]、[8]，而我们的发现则确立了其在支持JAK2-V617F组成性信号传导中的关键作用。
重要的是，尽管JAK2-V617F能够与所有EpoR WSXWS突变体发生物理相互作用，但其……
CRediT作者贡献声明
Megumi Funakoshi-Tago：项目主管、研究、资金获取、数据整理、概念化、论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写。Tomoki Sakata：研究、形式化分析、数据整理。Ueda Fumihito：方法学、研究、数据整理。Kenji Tago：研究、数据整理、论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写。
动物实验对象
本研究按照ARRIVE（体内动物实验报告）指南进行。
本研究经庆应大学动物使用委员会批准。
（批准编号：17033-(3)）
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的经济利益/个人关系：
| Megumi Funakoshi-Tago报告获得日本学术振兴会的资金支持。如有其他作者，他们声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争经济利益或个人关系。 |
致谢
感谢St. Jude儿童研究医院的James N. Ihle博士慷慨提供MSCV-Puro-EpoR-Flag载体。本研究部分由日本文部科学省（MEXT）／日本学术振兴会（JSPS）的资助支持（编号：23K06135）。
Megumi Funakoshi-Tago | Tomoki Sakata | Ueda Fumihito | Kenji Tago
日本庆应大学药学院卫生化学系，1-5-30 芝公园，港区，东京 105-8512，日本
