《Cellular Signalling》：Cystathionine beta-synthase alleviates intervertebral disc degeneration by inhibiting ferroptosis of nucleus pulposus cells via the PI3K-AKT Axis
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摘要：椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）是腰痛的主要原因，2020年全球影响6.19亿人，但目前尚无有效的疾病修饰疗法可逆转其进展。铁死亡（ferroptosis）已被证明通过诱导髓核细胞（nucleus
摘要：椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）是腰痛的主要原因，2020年全球影响6.19亿人，但目前尚无有效的疾病修饰疗法可逆转其进展。铁死亡（ferroptosis）已被证明通过诱导髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）损伤成为IVDD的核心驱动因素。胱硫醚β-合酶（cystathionine β-synthase, CBS）在IVDD中的调控作用及其潜在分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨CBS在IVDD中的生物学功能，并阐明其调节NPC铁死亡的机制。研究人员发现，CBS表达在退变的人NP组织和大鼠IVDD模型中显著下调，并与退变严重程度和铁死亡激活呈负相关。功能实验表明，敲低CBS显著加剧了叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide, TBHP）诱导的NPC基质代谢失衡、衰老和铁死亡，而CBS过表达则有效减轻了这些病理表型。转录组学分析、生化验证和药理学抑制实验提示磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路参与了CBS调控NPC铁死亡的相关效应。在体内实验中，给予S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine, SAM）可减轻针刺诱导的大鼠IVDD，恢复椎间盘高度和NP含水量，并抑制椎间盘内铁死亡。由于SAM具有多效性生物学作用，这些体内效应不能完全归因于CBS。综上所述，研究人员的发现支持CBS通过抑制NPC铁死亡对IVDD发挥保护作用，并提示PI3K-AKT信号通路是其中一条贡献途径。
研究背景与科学问题
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）是导致腰痛的主要病因，2020年全球患者达6.19亿人，预计至2050年将增至8.43亿，给医疗系统和经济带来沉重负担。目前临床治疗手段仅能缓解症状，无法有效逆转退变进程。椎间盘由髓核（nucleus pulposus, NP）、纤维环和软骨终板构成，其中髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）功能障碍是IVDD的关键因素，表现为代谢失衡、炎症和氧化应激加速退变。铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁和脂质过氧化的程序性细胞死亡形式，近年研究证实其在NPC损伤和IVDD进展中扮演核心驱动角色。然而，铁死亡在IVDD中的上游调控机制尚不明确。胱硫醚β-合酶（cystathionine β-synthase, CBS）是转硫途径的关键酶，负责催化同型半胱氨酸生成L-胱硫醚和硫化氢（H2S），具有抗氧化、抗炎等细胞保护功能，但其在IVDD中的作用及其与NPC铁死亡的关系此前未见报道。因此，研究人员开展本研究，旨在探明CBS在IVDD中的生物学功能及其调控NPC铁死亡的分子机制。
研究方法概述
研究人员首先利用公共转录组数据集GSE124272（包含8例腰椎间盘突出症患者和8例健康志愿者的外周全血样本）结合FerrDb铁死亡基因数据库进行生物信息学筛选，获得候选铁死亡相关基因CBS。随后收集苏州大学附属第一医院24例腰椎间盘突出症患者的NP组织（按Pfirrmann分级分为中度退变组和重度退变组）及SD大鼠IVDD模型（通过尾椎针刺不同深度构建不同程度退变）进行组织水平验证。体外实验采用原代分离培养的人NPCs，以叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide, TBHP）诱导氧化应激和铁死亡模型，通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低和慢病毒介导的过表达进行双向功能调控。研究人员运用蛋白质印迹法（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫荧光染色、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察线粒体形态，以及FerroOrange、BODIPY 581/591 C11、JC-1等荧光探针检测细胞内亚铁离子、脂质活性氧和线粒体膜电位。转录组测序结合基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析筛选下游信号通路，并通过PI3K抑制剂LY294002进行药理学验证。体内实验采用大鼠尾椎针刺IVDD模型，腹腔注射CBS变构激活剂S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine, SAM），通过X射线、磁共振成像（MRI）和组织学染色评估疗效。
研究结果
3.1 CBS表达与椎间盘退变相关：通过分析GSE124272数据集，研究人员鉴定出334个差异表达基因，与FerrDb铁死亡基因库取交集后获得包括CBS在内的6个候选基因。在人NP组织中，免疫组化、蛋白质印迹和RT-qPCR一致显示CBS在重度退变组（Pfirrmann IV/V级）的表达显著低于中度退变组（II/III级），Spearman相关分析和多变量线性回归均证实CBS表达与Pfirrmann分级呈显著负相关。TBHP处理的人NPCs中CBS蛋白和mRNA水平均下降，免疫荧光显示CBS降低伴随分解标志物MMP13升高和合成标志物ACAN降低。老龄（12月龄）大鼠NP组织中CBS表达较幼龄（2月龄）大鼠明显减少。
3.2 CBS敲低促进椎间盘退变进展：在TBHP处理的NPCs中，CBS敲低进一步上调MMP13和ADAMTS5、下调Collagen II和Aggrecan的蛋白及mRNA水平，加重基质代谢失衡。SA-β-gal染色显示CBS敲低增加衰老阳性细胞比例，活死细胞染色显示细胞死亡率升高，DCFH-DA荧光探针检测显示活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生显著增加。
3.3 CBS敲低增加NPC铁死亡易感性：CBS敲低使TBHP诱导的铁死亡促发蛋白ACSL4和PTGS2进一步升高，而铁死亡防御蛋白FTH1和GPX4进一步降低。TEM观察到典型铁死亡线粒体形态改变（皱缩、膜密度增高、嵴减少），JC-1染色显示线粒体膜电位下降，FerroOrange染色显示不稳定铁池扩大，BODIPY-C11染色显示脂质过氧化增强。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可部分逆转CBS敲低导致的衰老、氧化应激、细胞死亡和基质代谢紊乱。
3.4 CBS过表达减轻椎间盘退变相关表型：CBS过表达部分逆转TBHP诱导的MMP13和ADAMTS5升高、Collagen II和Aggrecan降低，减少SA-β-gal阳性细胞比例和PI阳性死亡细胞，并降低ROS水平。
3.5 CBS过表达抑制NPC铁死亡：CBS过表达部分逆转TBHP诱导的ACSL4和PTGS2升高及FTH1和GPX4降低，改善线粒体形态异常，维持线粒体膜电位，减少细胞内亚铁积累和脂质过氧化。
3.6 CBS调控NPC铁死亡涉及PI3K-AKT信号通路：转录组测序和KEGG富集分析提示PI3K-AKT信号通路为候选通路。蛋白质印迹证实CBS敲低减少TBHP处理下PI3K和AKT的磷酸化水平，而对总蛋白无明显影响。SAM处理可恢复PI3K和AKT磷酸化，而PI3K抑制剂LY294002可消除此效应，并部分逆转SAM对MMP13、ACSL4的下调和Collagen II、GPX4的上调。
3.7 SAM减轻大鼠针刺诱导的IVDD：在针刺诱导的大鼠IVDD模型中，腹腔注射SAM 8周后，MRI和X射线显示椎间盘高度指数（disc height index, DHI）部分恢复，MRI信号强度改善。苏木精-伊红（H&E）和番红O-固绿染色显示SAM减轻结构破坏和蛋白聚糖丢失，组织学评分降低。免疫组化显示SAM保存ACAN表达，免疫荧光显示GPX4表达升高。体内蛋白质印迹证实SAM恢复IVDD大鼠NP组织中PI3K和AKT的磷酸化水平。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次揭示CBS在IVDD中的保护作用及其通过抑制NPC铁死亡的新机制。CBS作为转硫途径限速酶，其下调与IVDD严重程度和铁死亡激活密切相关。双向功能调控实验证实CBS缺失加剧氧化应激下的基质代谢失衡、衰老和铁死亡，而过表达则发挥保护效应，这与Ferrostatin-1的药理救援结果一致，确认铁死亡是CBS缺乏相关NPC损伤的重要中介。转录组学和生化实验提示PI3K-AKT信号通路参与CBS调控的铁死亡效应，但GSEA未达到传统显著性阈值（FDR=0.113），LY294002的药理抑制虽支持该通路的贡献，但不能排除平行或补偿信号通路的作用。H2S可能是连接CBS与PI3K-AKT的分子桥梁。体内SAM给药可延缓IVDD进展，但由于SAM并非CBS选择性药物且具有多效性代谢作用，这些效应不能完全归因于CBS。研究局限性包括：未使用条件性CBS敲除模型验证SAM效应的CBS依赖性；缺乏PI3K/AKT遗传学挽救实验确定通路特异性；大鼠尾椎针刺模型不能完全模拟人类腰椎的生物力学复杂性；体外TBHP模型未能全面反映退变微环境的多因素特征。
研究结论：本研究首次鉴定了CBS在IVDD中的保护作用，并阐明了其涉及铁死亡调控的机制。CBS表达在退变人NP组织和大鼠IVDD模型中显著下调，与IVDD严重程度和铁死亡激活水平呈负相关。双向调控实验证实CBS缺失加剧TBHP诱导的NPC基质代谢失衡、细胞衰老和铁死亡易感性，而CBS过表达则减轻这些病理表型。机制上，CBS通过激活PI3K-AKT信号轴抑制NPC铁死亡发挥保护效应。体内实验进一步验证SAM可显著延缓大鼠IVDD进展。综上，研究人员的发现确立了CBS作为NPC铁死亡的新型内源性调控因子和IVDD的有前景的治疗靶点。
