《Clinica Chimica Acta》：Protocol for DNA extraction from QuantiFERON-TB gold tubes for PCR and sequencing applications
编辑推荐：
•开发了一种可重复且具有成本效益的协议，可直接从QuantiFERON-TB Gold管中提取高质量基因组DNA。•证明从QFT管中提取的DNA在质量、纯度和下游应用表现方面与传统EDTA血液样本所获DNA相当。•对所提取DNA的验证已扩展至高级分子应用领域，包括ARMS-P
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开发了一种可重复且具有成本效益的协议，可直接从QuantiFERON-TB Gold管中提取高质量基因组DNA。
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证明从QFT管中提取的DNA在质量、纯度和下游应用表现方面与传统EDTA血液样本所获DNA相当。
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对所提取DNA的验证已扩展至高级分子应用领域，包括ARMS-PCR和全外显子组测序，凸显其在基因组和生物标志物研究中的适用性。
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提出了一套实用的分析工作流程，增强了对常规LTBI诊断样本的利用，并支持免疫诊断检测与分子及基因组分析的整合。
引言
潜伏性结核感染（LTBI）仍是全球结核病（TB）消除计划面临的主要障碍之一，据估计全球近四分之一的人口处于结核分枝杆菌（Mtb）休眠状态[1]。尽管LTBI的流行率因地区而异，但在结核病高发国家以及感染或复活动风险增加的群体中，其负担尤为沉重，其中包括HIV合并感染者、免疫功能低下患者以及频繁接触Mtb的职业暴露医护人员。尽管LTBI感染者无症状，但仍面临终身复活动风险（尤其在免疫抑制状态下）[2]。早期识别LTBI至关重要，因为它能够及时启动预防性治疗，降低进展为活动性结核病（ATB）的风险，有助于控制疾病传播，并支持针对性预防治疗[3]、[4]。
QFT-Plus检测是一种干扰素-γ释放试验（IGRA），是目前最广泛使用的LTBI实验室诊断方法之一。QFT-Plus系统由四个血液收集管组成：Nil对照管、TB1抗原管、TB2抗原管和Mitogen阳性对照管。根据制造商方案，每管收集约1 mL全血，随后在37 °C下孵育16–24小时以刺激抗原特异性T细胞反应。孵育结束后，对试管进行离心，收集血浆用于检测干扰素-γ（IFN-γ），这是LTBI诊断的基础。本研究遵循标准临床QFT工作流程，随后从血浆收集后QFT管中残留的细胞组分中进行DNA提取。基因组DNA从Nil管、TB1管、TB2管和Mitogen管中回收，从而利用了常规诊断检测后本应废弃的材料。
尽管QFT检测具有诊断价值，但在资源有限地区仍存在若干局限性[5]、[6]。在巴基斯坦，该检测的高成本及对专用收集管的要求限制了其常规使用，许多实验室每周或每月才进行一次检测。因此，许多感染风险人群的LTBI诊断可及性仍然受限。核酸扩增检测（NAAT）和其他分子方法有望通过实现宿主遗传分析、生物标志物发现和精准医学策略来补充常规LTBI诊断，以深入了解潜伏感染的异质性。然而，这些研究需要高质量的基因组DNA。
在临床和研究环境中，仅为分子分析额外采集EDTA血液样本往往不切实际。LTBI状态仅在QFT结果出具后确认，使得对QFT阳性者进行回顾性EDTA血液采集十分困难。此外，反复静脉穿刺会增加患者不适感、样本采集成本及后勤复杂性，尤其在大样本队列研究中更为突出。这些局限性凸显了需要开发可靠方法，能够直接从常规采集的QFT样本中回收基因组DNA。
QFT管具有作为免疫学和基因组学研究双重用途样本的巨大潜力。然而，由于肝素锂可抑制下游酶促反应，而分离凝胶和低细胞含量使完整白细胞回收变得困难，从这些管中高效回收DNA在技术上仍面临挑战。粘性凝胶常粘附于移液器吸头并干扰沉淀物收集，使DNA提取过程劳动密集且容易出现样本丢失。因此，目前尚无标准协议能够从QFT管中稳定获得适合高级分子应用的高质量基因组DNA[7]。
本研究开发并优化了一套可直接从QFT管中提取最优质量基因组DNA的协议。将QFT管中提取的DNA与EDTA血液样本所获DNA在产量、纯度及下游PCR和测序应用表现方面进行了比较。评估了三种采用改良提取策略的商用DNA提取试剂盒，以确定提供最高质量DNA的方法。进一步优化后的协议针对QFT样本的特殊挑战进行了调整，建立了适合下游分子应用的基因组DNA回收可靠方法。
我们优化的协议表明，QFT管可作为下游分子分析可靠且此前未被充分利用的基因组DNA来源。通过实现直接从常规采集的诊断样本中提取DNA，该工作流程消除了额外采血的必要性，并促进了免疫诊断检测与分子及基因组应用的整合。从实验室医学角度来看，这种方法拓展了QFT样本在LTBI诊断之外的用途，为从同一临床样本支持分子研究提供了切实可行的途径。因此，所提方法可能促进未来生物标志物发现、大规模流行病学和遗传学研究以及数据驱动的诊疗策略，尤其在资源有限的医疗环境中具有重大意义。此外，常规采集的QFT样本可获得基因组DNA，有望支持LTBI易感性和进展的遗传学研究，从而有助于开发LTBI管理的个性化风险评估和精准医学方法。
章节摘要
研究设置
本研究获得伊斯兰堡国家医科大学机构审查委员会伦理审批，符合《赫尔辛基宣言》。所有参与者在采血前均获得书面知情同意。血液样本在伊斯兰堡圣家族医院和 Fauji基金会医院采集，肺结核（PTB）患者的EDTA管及结核接触者的QFT血液收集管用于样本采集。对于QFT
Multiskan SkyHigh微孔板分光光度计及凝胶电泳
采用手动提取方法及多种商用试剂盒进行了多次DNA提取，包括Thermo Scientific GeneJET基因组DNA纯化试剂盒、QIAamp DNA血液试剂盒和FavorPrep?血液基因组DNA提取试剂盒。使用Multiskan SkyHigh微孔板分光光度计评估所提取DNA的浓度和纯度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳进一步验证（补充文件1）。测量结果以
讨论
LTBI仍是全球消除结核病努力面临的主要挑战之一。LTBI感染者体内存在处于休眠状态的Mtb杆菌，无临床症状，但仍构成未来疾病复活动潜在储库[9]。LTBI诊断困难在于缺乏明显症状以及现有诊断工具的局限性。在现有方法中，QFT检测通过干扰素-γ释放被广泛用于检测Mtb感染[10]。
结论
据我们所知，本研究是首个开发并验证经济实惠的协议，可直接从QFT管中提取基因组DNA用于PCR和全外显子组测序应用。优化后的协议始终能产生质量充足、完整性良好的DNA，满足可靠下游分子分析需求，同时拓展了QFT样本在常规干扰素-γ检测之外的用途。通过消除额外采血的需要，该方法减少了患者
CRediT作者贡献声明
Urooj Subhan：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿撰写，调查，形式分析，数据整理。Zaineb Akram：撰写 – 审阅与编辑，可视化，验证，方法学，调查，数据整理，概念构思。Sara Shafqat：数据整理。Sidra Younis：撰写 – 审阅与编辑，可视化，验证，监督，资源，项目管理，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念构思。
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究由巴基斯坦拉瓦尔品第国家医科大学（NUMS）及巴基斯坦高等教育委员会通过NRPU项目（HEC-NRPU-15101）资助。
生成式AI及AI辅助技术在稿件准备过程中的声明
在本工作准备过程中，作者使用Chat-GPT以提高章节的可读性和语言表达。使用此工具后，作者按需审阅并编辑了内容，对已发表章节的内容承担全部责任。
Urooj Subhan|Zaineb Akram|Sara Shafqat|Sidra Younis
