升温抑制广温性鳉鱼（Cyprinodon nevadensis amargosae）卵巢类固醇生成并扰乱雌激素反馈调控

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Elevated temperature suppresses ovarian steroidogenesis and disrupts estrogen feedback regulation in the eurythermal pupfish Cyprinodon nevadensis amargosae

　　

异常升高或持续较长时间的温度升高可损害硬骨鱼类的生殖过程。在许多物种中，处于生殖周期特定时期暴露于异常高温可降低卵子数量或质量、损害精子活力，甚至导致完全生殖失败。尽管高温可能通过多种生理机制损害生殖，但调节生殖过程的激素信号通路的热敏感性已成为高温下生殖抑制的核心因素。在雌性硬骨鱼类中，升高的温度干扰下丘脑–垂体–性腺（HPG）轴内分泌信号，可减少垂体释放促卵泡激素（Fsh）和促黄体生成素（Lh），并减弱促性腺激素对卵巢的刺激。其结果是，高温下卵巢类固醇生成受到抑制，导致循环中17β-雌二醇（E2）浓度降低，最终损害卵子发生，使雌鱼产卵数量减少或卵子变小、卵黄含量降低或卵膜变薄。在本研究中，研究人员检测了不同温度条件如何影响成年雌性阿马戈萨河鳉鱼（Cyprinodon nevadensis amargosae）卵巢类固醇生成和卵黄蛋白摄取通路的E2反馈调控。研究人员将性成熟雌鱼分别驯化于20?°C、28?°C或36?°C，随后给予单次外源E2或载体溶液注射，检测卵巢中促性腺激素受体（fshr、lhcgr）、类固醇生成通路基因（star、cyp11a1、3βhsd）、芳香化酶（cyp19a1a）、卵黄蛋白原受体（vtgr）和脂蛋白脂肪酶（lpl）的mRNA转录本丰度。研究发现，升温降低了血浆E2、卵巢性腺指数（GSI）及促性腺激素受体mRNA水平；E2仅在较冷温度（20?°C、28?°C）下下调类固醇生成基因表达；芳香化酶（cyp19a1a）在36?°C下仍对E2有响应，提示部分雌激素受体（ER）信号完整；脂蛋白脂肪酶（lpl）mRNA受升温抑制且在36?°C下对E2无响应；卵巢卵黄蛋白原受体（vtgr）mRNA不受温度或E2影响。这些发现揭示了高温通过抑制卵巢类固醇生成通路和扰乱E2负反馈调控而损害雌鱼生殖性能的分子机制。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

异常高温可损害硬骨鱼类的生殖过程，包括降低卵子数量与质量、损害精子活力乃至导致完全生殖失败。在雌鱼中，高温干扰下丘脑–垂体–性腺（HPG）轴内分泌信号，减少垂体促卵泡激素（Fsh）和促黄体生成素（Lh）的释放，从而减弱促性腺激素对卵巢的刺激。其后果是卵巢类固醇生成受抑，循环17β-雌二醇（E₂）浓度下降，最终损害卵子发生。虽然高温对卵巢促性腺激素受体和类固醇生成酶表达的抑制作用已有较多报道，但高温如何影响E₂对卵巢类固醇生成通路的负反馈调控仍不清楚。此外，高温是否影响卵巢卵黄蛋白原受体（vtgr）和脂蛋白脂肪酶（lpl）的表达、从而损害卵母细胞对卵黄前体和脂质的摄取能力，此前尚未被研究。阿马戈萨河鳉鱼（Cyprinodon nevadensis amargosae）是一种栖息于美国死亡谷地区极端热环境中的广温性鱼类，具有异步卵泡发育特征，其生殖上限温度在已检测鱼类中名列前茅，是研究温度依赖性生殖内分泌调控的理想模型。本研究旨在探究不同温度条件下E₂对卵巢类固醇生成和卵黄摄取通路的反馈调控是否发生改变。

二、研究内容与主要结论

研究人员将性成熟雌鱼分别驯化于20?°C、28?°C和36?°C三种恒温条件14天，随后对部分雌鱼给予单次腹腔注射外源E₂（5?μg?g^?1体重）或载体溶液，16–18小时后取样检测卵巢基因表达。研究发现：升温显著降低血浆E₂浓度和卵巢性腺指数（GSI），并改变卵泡发育阶段分布——36?°C下晚期核仁周（LPN）期卵泡比例升高、脂滴（LD）期卵泡比例降低。卵巢促性腺激素受体（fshr、lhcgr）和类固醇生成通路基因（star、cyp11a1、3βhsd、cyp19a1a）mRNA丰度在高温下均显著下降。E₂在20?°C和28?°C下可下调star、cyp11a1、3βhsd、fshr、lpl等基因表达，但在36?°C下这些负反馈效应消失；唯独cyp19a1a在36?°C下仍对E₂有响应。卵巢三种雌激素受体（esr1、esr2a、esr2b）mRNA丰度随温度升高而下降，提示高温可能通过降低ER表达而削弱卵巢对E₂信号的转导能力。卵巢shbg mRNA在36?°C基础组中升高。vtgr表达不受温度和E₂影响，而lpl在高温下受抑且在36?°C下对E₂无响应。这些结果揭示了高温通过多层面抑制卵巢类固醇生成通路并扰乱E₂负反馈调控而损害雌鱼生殖性能的分子机制。

三、主要关键技术方法

本研究使用了以下关键技术方法：①实验鱼采集自美国加利福尼亚州Tecopa Bore沼泽栖息地（35°53.140′N，116°14.050′W），该地水温年均33.0?±?3.6?°C；②三种恒温处理（20?°C、28?°C、36?°C）结合外源E₂腹腔注射（5?μg?g^?1体重）的实验设计；③卵巢组织苏木精–伊红（H&E）染色组织学分析用于卵泡分期；④酶联免疫吸附测定（ELISA）定量血浆E₂和睾酮（T）浓度；⑤逆转录实时定量PCR（qPCR）检测卵巢靶基因mRNA相对表达丰度，以ef1α、tbp、rpl8、actb为内参基因。

四、研究结果

4.1 温度对卵巢GSI和卵泡发育的影响

36?°C下雌鱼卵巢质量与体重正相关关系消失，卵巢GSI显著低于20?°C和28?°C组。组织学分析显示36?°C下晚期核仁周（LPN）期卵泡比例显著升高，脂滴（LD）期卵泡比例显著降低，提示高温阻滞了卵泡向脂滴期的发育进程。所有卵巢样本中未观察到闭锁卵泡。

4.2 血浆E₂和T浓度

36?°C下基础组、载体注射组和E₂注射组雌鱼血浆E₂浓度均显著低于较冷温度组。外源E₂注射在各温度下均显著升高血浆E₂浓度。血浆T浓度不受温度或E₂注射影响。个体血浆E₂浓度与LPN期卵泡比例呈负相关，与LD期卵泡比例呈正相关。

4.3 温度与E₂对卵巢促性腺激素受体mRNA的影响

基础组雌鱼在高温下卵巢fshr和lhcgr mRNA丰度均显著降低。E₂注射在20?°C下显著下调fshr mRNA，但在28?°C和36?°C下无此效应。E₂在各温度下均下调lhcgr mRNA，但高温本身也降低lhcgr表达。

4.4 温度与E₂对卵巢类固醇生成通路的影响

基础组雌鱼在高温下卵巢star、cyp11a1、3βhsd和cyp19a1a mRNA丰度均降低。E₂在20?°C和28?°C下可下调star、cyp11a1、3βhsd和hsd17β3表达，但在36?°C下这些负反馈效应消失。cyp19a1a在三个温度下均受E₂下调，说明其E₂响应性在高温下仍保留。11βhsd不受温度或E₂影响。

4.5 卵巢雌激素受体mRNA表达

卵巢esr1、esr2a和esr2b mRNA丰度在基础组中均随温度升高而下降。E₂注射仅在20?°C下下调三种ER mRNA，在28?°C和36?°C下无显著效应。

4.6 卵巢shbg mRNA水平

基础组雌鱼在36?°C下卵巢shbg mRNA丰度显著高于20?°C和28?°C组。注射组中温度和E₂对shbg mRNA无显著影响。

4.7 卵巢卵黄蛋白原受体和脂蛋白脂肪酶表达

卵巢vtgr mRNA丰度不受温度或E₂影响。卵巢lpl mRNA在高温下显著降低；E₂在20?°C和28?°C下可下调lpl表达，但在36?°C下无此效应。

五、讨论与结论

本研究表明，36?°C高温通过多层面机制损害雌性阿马戈萨河鳉鱼的卵巢类固醇生成和卵母细胞营养供给：①抑制卵巢促性腺激素受体表达，降低卵巢对垂体促性腺激素信号的敏感性；②抑制类固醇生成通路多个关键酶基因表达，直接降低卵巢合成E₂的能力；③降低三种雌激素受体表达，削弱卵巢对E₂信号的转导能力，导致E₂对类固醇生成基因和lpl的负反馈调控在36?°C下消失；④抑制lpl表达，可能损害卵母细胞对脂质的摄取。cyp19a1a在高温下仍保留E₂响应性，提示部分ER信号通路在高温下仍完整。卵巢vtgr表达不受温度和E₂影响，说明卵黄蛋白摄取受体水平并非高温损害卵母细胞营养供给的限速环节。这些发现揭示了高温损害雌鱼生殖性能的卵巢分子机制，为理解广温性鱼类在气候变暖背景下的生殖响应提供了重要依据。